قياس سلوك الأسماك سباحة ردا على التعرض الحاد للمائي النحاس عن طريق الكمبيوتر بمساعدة الفيديو الرقمية وتحليل الصور

Summary

قياس تأثيرات الملوثات البيئية على سلوك الأسماك في كثير من الأحيان شخصي وتحديا من نوع خاص عند التعامل مع النهاية دون المميتة. وصفنا الأساليب بما في ذلك تكنولوجيا الفيديو لتحديد السلوك السباحة من الحياة المبكرة مرحلة الأبيض سمك الحفش (أسيبنسر ترانسمونتانوس) أثناء وبعد 96 ساعة التعرض الحاد لتركيزات مختلفة من النحاس.

Introduction

فهم كيفية التعرض الملوثات يمكن أن تؤثر على السلوك غير في أوقات صعبة للغاية وشخصي. ويعرف السلوك عادة على شكل سلسلة من العلنية يمكن ملاحظتها، والأنشطة، كامل الجسم التي تعمل من خلال الجهاز العصبي المركزي وتمكن الكائن من البقاء على قيد الحياة، وتنمو، وتتكاثر. التغييرات في السلوك بسبب التعرض لمادة سامة هي من بين المؤشرات الأكثر حساسية من الإجهاد البيئي في كثير من الأحيان بين 10-100 مرات أكثر حساسية بالمقارنة مع البقاء على قيد الحياة ^1. غالبية هذه الدراسات درست السباحة النشاط، والتهوية، ويبحث الفأر سلوك ^2،3،4 الأسماك. السباحة النشاط هو الأكثر استخداما نقطة النهاية دون المميتة في تحديد التغيير السلوكي ردا على الملوثات في اختبارات السمية ^5. وتشمل المتغيرات السباحة وتيرة ومدة الحركة والسرعة والمسافة المقطوعة، وتواتر وزاوية من الأدوار، والموقف في عمود الماء ونمط السباحة. نشاط السباحةتدبيرا فعالا لسلوك السباحة عند تقييم حساسية لمادة سامة على أساس المعايير المقترحة في الفصل 9 من راند ⁶ في أصول كتاب المائية السموم.

تقدم هذه الورقة دراسة السمية كمثال لكيفية سمية النحاس إلى المراحل الأولى من حياة سمك الحفش الأبيض (أسيبنسر ترانسمونتانوس) في مراحل مختلفة من التنمية في وقت مبكر في الماء فقط التعرض نسبة إلى سمك الحفش تم تقييم سلوك السباحة وتوضح أساليب لقياس السباحة سلوك.

في دراسات سابقة، كانت الاستجابات السلوكية السلبية واضحة مع بداية مبكرة خلال الأيام القليلة الأولى من التعرض الحاد والمزمن للنحاس وأصبحت تدريجيا أكثر شدة على مدة التعرض ^و7،8،9 التركيز. هي حجم وتوقيت ظهور هذه الاستجابات السلوكية المرجح كافية للحد من البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل، وبالتالي يشكل مصدر قلق نظرا للآثار لrecruiفشل tment ^10. من أجل تفسير دقيق لأهمية هذه الحساسية لأساليب وإجراءات التعرض معدنية وضعت لقياس دوام ومدى ضعف السلوكية النسبية لتركيزات النحاس.

تم تأسيس بروتوكولات لاختبار وظيفة السلوكية والتنمية من خلال تحليل عينات الفيديو العامة من سمك الحفش في غرف التعرض. قدمت عينات فيديو التقييم النوعي للتنمية وظيفة من بين العلاجات النحاس طوال فترة التعرض. وتم تقييم السلوك والمأوى التماس النشاط خلال التعرض لتركيزات النحاس المائية لتحديد الوقت لتفعيل وتميز التسلسل الزمني للضعف الذي يؤثر تسعى المأوى والخمول، والسباحة التنسيق والتوازن، والتنفس. وبالإضافة إلى ذلك، أدلى تسجيلات الفيديو من سمك الحفش subsampled من كل تكرار لغرض توثيق كميا تشغيل إشارات السباحة العفويvity. وتضمنت هذه النهاية التدابير لمدة أو الوقت تتحرك، السباحة السرعة والمسافة المقطوعة ^5،11 باستخدام المتاحة تجاريا الصورة الرقمية حزمة برامج التحليل. هذا البرنامج يحدد الخطوط العريضة للكل صورة داخل مجال الرؤية ومن هذا، ويعرف النقطه الوسطى لكل صورة. البرنامج ثم يمكن تتبع موقف كل النقطه الوسطى في إطار بالخلافة إطار لتحديد مسارات الحركة.

هذه الدراسة امتثلت لجميع أقسام المعمول بها في قوانين الختامية لوائح قانون رعاية الحيوان (9 CFR) ومع جميع المبادئ التوجيهية المؤسسية من أجل المعاملة الإنسانية للكائنات الاختبار خلال الثقافة والتجريب. عند انتهاء الدراسة، والموت الرحيم جميع الأسماك وفقا للمبادئ التوجيهية الملائمة التي وافقت عليها لجنة الحيوان الرعاية المؤسسية واستخدام لهيئة المسح الجيولوجي الأميركية، مركز بحوث البيئة في كولومبيا.

Protocol

1. مخففة الإعداد لليرقات سمك الحفش التعرض لتركيزات النحاس مائي

1. إعداد التعرض باستخدام نظام تدفق من خلال مثل نظام ¹² مخففة جبل وBrungs المعدلة التالية المبادئ التوجيهية التي الدولية ^13،14،15 ASTM.
2. تحديد 25 ميكروغرام / لتر تركيز النحاس عالية بناء على نتائج اختبار السابقة حيث لوحظت آثار حوالي 4-6 ميكروغرام / لتر. استخدام كاشف الصف النحاس الثاني pentahydrate كبريتات (> 98٪ نقاء) وخلط محلول المخزون الاختبار.
   ملاحظة: مثال تركيز سلسلة التعرض للهي 25، 12.5، 6.25، 3.125، 1.0625، و0 ميكروغرام / لتر. وذلك باستخدام التخفيفات المسلسل 50٪ بدءا من 25 ميكروغرام / لتر تركيز عال استهداف مجموعة من تركيزات وحظ أن يسبب ضعف السلوكي.
3. إعداد محلول المخزون اختبار في قارورة حجمية قبل 48 ساعة من بدء التعرض والمقرر أن يسلم إلى ارتفاع غرفة الخلط مخففة باستخدامالآلي حقنة موزع.
4. استخدام قالب جدول لتحديد وزن المواد الكيميائية التي يمكن ان تضاف الى 1 لتر من الماء منزوع الأيونات التي من شأنها أن تؤدي إلى 25 ميكروغرام / لتر تركيز النحاس، عندما ارتفعت غرفة الخلط مخففة مع 1 مل من محلول المخزون الاختبار.
   ملاحظة: الشكل 1 يصور مثال على قالب جدول بيانات لإعداد الأوراق المالية الكيميائي للاختبارات مخففة سمية.
5. تزن من 195 ملغ من كاشف الصف النحاس الثاني pentahydrate كبريتات باستخدام الميزان التحليلي وتصب في 1 لتر الحجمي قارورة وتخلط مع 1 لتر من الماء منزوع الأيونات لتركيز الأسهم من 48.65 ملغم / لتر.
6. وضع أنبوب كمية من موزع حقنة الآلي في حل الأسهم اختبار وتعيين حجم الارتفاع إلى 1 مل وتحويل مخففة على طريق التقليب مفتاح الطاقة، والسماح دورة لمدة 48 ساعة وتسمح لها تتوازن مع تركيز النحاس المقابلة قبل التخزين سمك الحفش.
7. إرفاق في خط 4 في اتجاه تدفق الخائن ملاحظة: يتم تنظيم هذه العملية عن طريق استخدام جهاز توقيت الآلي.
8. تعيين مخففة لدورة كل 30 دقيقة باستخدام الموقت الآلي ولتقديم 250 مل من الماء اختبار مع كل دورة، مما أسفر عن 12 حجم الإضافات يوميا إلى كل تكرار غرفة الاختبار.
9. اختر غرف اختبار التعرض على أساس حجم سمك الحفش للحفاظ على معدل مقبول التحميل التي هي <10 ز الأسماك الوزن الرطب / L في أي غرفة في أي وقت من الأوقات. على سبيل المثال، لإجراء التعرض مع 30 يوما بعد الفقس (الفقس) سمك الحفش الأبيض (متوسط ​​الوزن بالجرام 0.17 ز) استخدام 12 ×21.5 سم ² وعاء زجاجي مع وجود ثقب 4 سم في الجانب. تغطية هذا الجانب مع شبكة الشاشة الفولاذ المقاوم للصدأ 30 ميكرون للسماح لتدفق من خلال لاختبار المياه. حجم المياه اختبار في الجرار التعرض 1 L.
10. استخدام 50 مل حقنة بلاستيكية تأخذ اثنين من تكرار 50 مل عينات المياه في كل تركيز لما مجموعه 12 عينة والاستغناء عن مياه الاختبار في 100 الأكواب مل الزجاج وقياس الأكسجين الذائب (DO)، ودرجة الحرارة، والتوصيل، ودرجة الحموضة، والقلوية، والصلابة، المجموع والأمونيا، والكاتيونات الرئيسية، الأنيونات الرئيسية والكربون العضوي المذاب باستخدام المعدات التجارية القياسية واتباع تعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: يجب أخذ العينات في بدء ونهاية التعرض.
11. لجمع عينات فرعية للتحليل الكيميائي، استخدام 25 مل حقنة بلاستيكية، ووضع ما يقرب من 24 مل من الماء اختبار من الدوائر التعرض باستخدام قش sipper تعلق على حقنة بدلا من إبرة.
12. إزالة القش sipper من سيخواتم ووضع فلتر البولي بروبلين خرطوشة الإسكان 0.45 ميكرون حجم المسام، غشاء polyethersulfone على حقنة بلاستيكية.
13. دفع 4 مل من الماء اختبار من خلال تصفية والتخلص منها.
14. الاستغناء عن 20 مل المتبقية من الماء اختبار من خلال مرشح في زجاجة البولي ايثيلين حمض تنظيفها وتحمض إلى 1٪ حجم / حجم مع نقاء عالية، 16 حمض النيتريك M لتخزين ما يصل إلى 3 أشهر.
    ملاحظة: يجب أخذ عينات للتحليل الكيميائي في بدء ووسط ونهاية من التعرض لتأكيد تركيزات النحاس.
15. إجراء تحليل كيميائي باستخدام إضافة بالحث البلازما الطيفي التالية حماية البيئة في الولايات المتحدة طريقة كالة 6020a ¹⁷
16. بعد اتخاذ جميع عينات المياه ومخففة وركوب الدراجات، والأوراق المالية 10 (عشوائية، كيفما اتفق) سمك الحفش في كل تكرار غرفة الاختبار. جمع سمك الحفش من خزان الثقافة حيث يتم إيواؤهم باستخدام شبكة سلكية صغيرة غير جلخ. وضع سمك الحفش في دلو صغيرر بالماء الثقافة. وهناك حاجة لبدء التعرض ما مجموعه 240 الأسماك.
17. لا إطعام الأسماك أثناء التعرض.
    ملاحظة: يرجى الرجوع إلى الشكل (1) الإعداد البصري للتخطيط مخففة.
18. قراءة اختبار كل يوم لمدة فيات التعرض والأسماك سجل ومراقبة السباحة السلوك.
    ملاحظة: السلاسل الأخرى للبحث عن تشمل الخمول، فقدان التوازن، والتغيرات في التنفس، والتغيرات في لون والأسماك موقف هي في عمود الماء، يختبئ النشاط وأي تشوهات أخرى يمكن التعرف بصريا.
    ملاحظة: اقرأ اختبار في نفس الوقت كل يوم من أجل التناسق.
19. قياس وقياس النشاط السباحة (أنفقت الأسماك وقت التحرك والسرعة وانتقلت بعد) باستخدام المتاحة تجاريا الرقمي برنامج تتبع البرامج.

2. الملاحظات والتهم الوفيات خلال التعرض

1. تفقد البصر كل الفصل اختبارالعنبر وفيات المذكرة والملاحظات من السلوك الشاذ باستخدام قائمة مرجعية سلوكية (الجدول 1) على أوراق البيانات تقريبا في نفس الوقت يوميا خلال التعرض 96 ساعة، ويفضل في الصباح.
   ملاحظة: السلوكيات التي لافت للنظر، على نحو غير معهود، ذاتي، مختلفة نوعيا عن الضوابط تعتبر غير طبيعية. على النحو الأمثل المراقب يجهل من العلاجات.
   ملاحظة: يتم تعريف فقدان التوازن، عدم قدرة الأسماك للحفاظ على وضع رأسي في عمود الماء ويعرف الجمود أنه عجز الأسماك لنقل أو السباحة إلا إذا حث. تشوهات أخرى مثل الخمول، وفرط النشاط، والزيادة أو النقصان في التنفس، ويتغير لونها، والهزات، وتشنجات، البطن المنتفخة، والموقف في عمود الماء وأي أنماط غير عادية السباحة أخرى ينبغي أيضا أن تسجل على ورقة البيانات.
   ملاحظة: يرجى الرجوع إلى الفيديو 1 للحصول على أمثلة من غير طبيعيةسلوك.
2. سجل وإزالة سمك الحفش القتلى يوميا.
3. باستخدام اليد التي عقدت الأكسجين الذائب (DO) متر مع التحقيق قياس الأكسجين الذائب في الموقع وتسجيل درجة حرارة الماء في اثنين من مكررات لكل تركيز التعرض وسجل على ورقة البيانات.

3. التسجيل على شريط فيديو آخر سباحة

1. القبض على عينات بيانات الفيديو باستخدام كاميرا الفيديو المحمولة باليد التي شنت على ترايبود وضعه مباشرة فوق الغرفة اختبار لتوثيق الانحرافات السلوكية.
2. لقياس النشاط السباحة، وقطع قطعة من البلاستيك 13 الأنابيب سم وقطرها 13 سم لاستخدامها بوصفها الساحة اختبار (الشكل 1). وضع الأنابيب البلاستيكية في مخففة في المقابلة كل الدبابات التعرض تركيز النحاس. استخدام منطقة داخل الأنابيب البلاستيكية كما الساحة الاختبار لأن هذا هو كبير بما فيه الكفاية لسمك الحفش على السباحة بحرية.
3. في نهاية تعرض 96 ساعة، عينة فرعية عشوائيا 5 الباقين على قيد الحياة سمك الحفش من كل concentratio النحاسن لقياس لنشاط السباحة ووضعها في لالساحة اختبار باستخدام شبكة سلكية صغيرة.
   ملاحظة: في تركيزات اختبار أعلى حيث كان معدل الوفيات سمك الحفش السائدة، وينبغي أن تستخدم أي سمك الحفش على قيد الحياة المتبقية لقياس النشاط السباحة وفي بعض الحالات قد يكون أقل من 5.
4. بعد وضع الأسماك في لالساحة الاختبار، تسمح للأسماك ليتأقلم لمدة 30 دقيقة.
   ملاحظة: الناجحة، خطأ تحليل خال من الفيديو يتطلب النقيض من الصورة عالية من الأسماك على خلفية مع حد أدنى من الهيكل الذي قد يحجب أو إخفاء صورة السمكة. يجب أن تكون الصورة من الأسماك في التركيز جيدا ويجب أن تكون خالية من وهج سطح أو خالية من التشوهات الناجمة عن نقل المياه لذلك يجب تشغيل نظام مخففة قبالة.
5. بعد 30 دقيقة، وتحويل على كاميرا فيديو وتعيين إلى REC لتسجيل النشاط السباحة لمدة 2 دقيقة.
6. الموت ببطء الأسماك بعد أخذ تسجيلات الفيديو لتحديد تكونبسلوك.
7. وضع سمك الحفش في محلول تريكين methanesulfonate (MS222) الماء لمدة 10 دقيقة على الأقل للسماح لوقف حركة صادي.
   ملاحظة: ينصح تركيز لا يقل عن 250 ملغم / لتر وقد يكون أعلى من ذلك بكثير بالنسبة لبعض الأنواع.
8. وضع سمك الحفش الموت الرحيم في كيس الرمز البريدي قفل البلاستيكية ووضعها في الثلاجة للتخلص منها في وقت لاحق. أوقف تشغيل الكاميرا والفيديو ونقل جميع ملفات الفيديو إلى جهاز كمبيوتر لمرحلة ما بعد المعالجة باستخدام برنامج تتبع الرقمي.

4. مقاييس آخر سباحة من تشغيل الفيديو

1. موقع ملفات البيانات ورقة البيانات والفيديو للتجربة ليتم تحليلها. تحويل ملفات الفيديو إلى تنسيق متوافق يمكن التعامل مع برامج التحليل الرقمي.
2. تحميل جميع الملفات التي سيتم تجهيزها في صناعة البرمجيات. تتبع البرمجيات مفتوحة من خلال النقر على الرمز. انقر على "التجربة الافتراضية الجديدة" تحت عنوان "خلق تجربة جديدة" سption على الشاشة الرئيسية.
3. أدخل اسما للتجربة في مربع الحوار "تجربة جديدة" التي تظهر على الشاشة. اختيار موقع الملف التجربة هي ليتم حفظها. انقر على زر "موافق". اختيار "إعدادات تجربة" الخيار تحت عنوان "إعداد". اختيار "من ملف الفيديو" تحت عنوان "الفيديو المصدر".
4. حدد "1" إلى "عدد من الساحات". حدد "3" ل "عدد من الموضوعات في الساحة". حدد "كشف مركز نقطة" تحت عنوان "ملامح مجنزرة". تحديد الوحدات المطلوبة.
5. حدد الخيار "قائمة المحاكمة" تحت عنوان "إعداد". انقر على "أضف كليب" في أعلى الشاشة. اختيار "الترتيب الأبجدي" تحت خيار "ترتيب الفرز" في مربع الحوار "إضافة فيديو" التي تظهر على الشاشة. انقر على زر "استعراض". انتقل إلى المجلد حيث توجد ملفات الفيديو.
6. تسليط الضوء على جميع ملفات الفيديو. انقر فوق "فتح". انقر على "إضافة متغير" في أعلى الشاشة. أدخل "تركيز" إلى "تسمية "مربع. أدخل" تركيز النحاس في ميكروغرام / لتر "إلى" مربع الوصف ".
7. اختيار "العددية" من القائمة المنسدلة ل "النوع". انقر على مربع "القيم المحددة مسبقا". اختر "تحديد القيم الفردية" الخيار في مربع الحوار "تحديد مسبق القيم العددية" التي تظهر.
8. أدخل "0"، "3"، "6"، "13"، "25"، و "50" في الفضاء "المعرفة مسبقا القيمة". انقر على "أضف >>" بين كل إضافة الرقم. قم بإلغاء تحديد "السماح قيم أخرى" الخيار. انقر على زر "موافق".
9. اختيار "المحاكمة" من القائمة المنسدلة في مربع "نطاق". أدخل التركيز المناسب لكل محاكمة في صناديق المقدمة. انقر على "إضافة متغير" في أعلى الشاشة. أدخل "تكرار" إلى مربع "تسمية". أدخل "تكرار رقم" إلى مربع "الوصف". اختيار "العددية" من القائمة المنسدلة ل "النوع".
10. انقر على "Pقيم إعادة تعريف "مربع اختر" تحديد القيم الفردية "الخيار في" مسبق القيم العددية "مربع الحوار. أدخل" 1 "،" 2 "،" 3 "و" 4 "في" المعرفة مسبقا قيمة "الفضاء. انقر فوق" إضافة >> "بين كل إضافة الرقم. قم بإلغاء التحديد" السماح قيم أخرى "option.Click" موافق ".
11. اختيار "المحاكمة" من القائمة المنسدلة في مربع "نطاق". أدخل عدد تكرار المناسب لكل محاكمة في صناديق المقدمة. اختيار "إعدادات الساحة" ضمن علامة التبويب "إعداد" في أعلى الشاشة. الاسم الأول وضع "محاكمة 1". انقر على الخيار "انتزاع صورة الخلفية" من "الساحة إعدادات (محاكمة 1)" مربع الحوار.
12. انقر على زر "استعراض" في مربع الحوار "انتزاع صورة الخلفية". تحديد موقع ملف فيديو لمحاكمة (1) وانقر فوق "فتح". انقر على الخيار "المسكة" في مربع الحوار "انتزاع صورة الخلفية" بعد ظهور الفيديو. انقر على أيقونة دائرة بيضاء قرب أعلى اوند الشاشةإيه "الساحة إعدادات".
13. التلاعب دائرة التي تظهر بحيث يتم وضع منطقة السباحة كلها في الدائرة. تظهر علامات هاتش حيث يتم تعريف منطقة الساحة. انقر أيقونة "معايرة مقياس" بالقرب من أعلى الشاشة تحت "إعدادات الساحة". غادر انقر على حافة واحدة من الساحة. عقد واسحب الماوس فوق إلى الطرف الآخر من الساحة. إطلاق سراح فوق اليسار.
14. أدخل "10.5" في مربع "المسافة العالم الحقيقي" في مربع الحوار "معايرة بعد" التي تظهر. انقر على زر "موافق". إذا لزم الأمر، وضبط خط المعايرة بحيث يمتد القطر كله من الساحة الدائرية.
15. انقر على الخيار "التحقق من صحة الساحة إعدادات" على "الساحة إعدادات (محاكمة 1)" مربع الحوار. معالجة أي مشاكل إذا لم يتم التحقق من صحة الإعدادات. انقر على الحق "الساحة الإعدادات" تحت خيار "الإعداد" من شريط الأدوات "تجربة إكسبلورر" على يسار الشاشة واختر "جديد" من القائمة.
16. كرر الخطوات 4،11-4،15 حتى إعدادات الساحة حافي أنشئت لكل محاكمة. تأكد من اختيار ملف الفيديو المناسب لكل المحاكمة. اختيار "إعدادات كشف" تحت خيار "الإعداد" من شريط الأدوات "تجربة إكسبلورر" على يسار الشاشة.
17. اختيار "الحيوي الطرح" من القائمة المنسدلة تحت عنوان "أسلوب" في "كشف إعدادات: إعدادات كشف 1" مربع الحوار الذي appears.Choose ألوان التعبئة مختلفة عن كل موضوع تحت عنوان "تحديد موضوع" في: حوار "إعدادات الكشف عن إعدادات كشف 1" مربع.
18. اختيار "اختر فيديو" وتحديد فيديو لمحاكمة 1.Click "فتح". حدد "5.9941" من مربع "معدل عينة" تحت عنوان "فيديو" في "كشف إعدادات: إعدادات كشف 1" مربع الحوار. انقر على "إعدادات" لخيار "صورة المرجع" تحت عنوان "كشف" في: مربع الحوار "كشف إعدادات الضبط كشف 1".
19. انقر على زر "ابدأ التعلم (C)4؛ الخيار في "مرجع صورة" حوار box.Wait للبرنامج لمعرفة الصورة المرجعية. عندما تظهر الصورة في مربع الحوار "مرجع صورة" من دون الحيوانات، انقر فوق "استخدام صورة مرجع حيوية" تحت عنوان "إعدادات اقتناء" في مربع الحوار.
20. انقر على زر "إغلاق". اختيار "أغمق" من القائمة المنسدلة ل"الموضوع هو" تحت عنوان "كشف" في: مربع الحوار "كشف إعدادات الضبط كشف 1". تعيين عدد أقل من "33" وعدد أكبر إلى "153" ل "على النقيض من الظلام" تحت عنوان "كشف" "كشف إعدادات: إعدادات كشف 1" مربع الحوار.
21. انقر على "حفظ التغييرات" في أسفل يمين: مربع الحوار "كشف إعدادات الضبط كشف 1". انقر على زر التشغيل في مربع الحوار "التحكم في تشغيل" والتأكد من أن البرنامج هو تتبع بنجاح الحيوانات بدلا من الظلال أو الحطام. ضبط أرقام ل "الكونترا الداكنةر "عند الضرورة.
22. مرة واحدة تتبع المناسب، انقر على "حفظ التغييرات" في أسفل يمين: مربع الحوار "كشف إعدادات الضبط كشف 1". اختيار "شراء" تحت خيار "الإعداد" من شريط الأدوات "تجربة إكسبلورر" على يسار الشاشة.
23. انقر على "المسار محاكمة مقررة المقبلة" في مربع الحوار "إعدادات اقتناء". تأكيد يتم عرض الإعداد محاكمة والفيديو والساحة الصحيح تحت "إعدادات" في مربع الحوار "إعدادات اقتناء".
24. التحقق من الخيار "يحدد كشف السرعة" في مربع الحوار "التحكم في اقتناء". انقر على زر مع دائرة خضراء المغلقة في مربع أبيض لبدء عملية الاستحواذ. كرر الخطوات 4،22-4،23 حتى يتم تعقب جميع المحاكمات.
25. انقر على "ملفات البيانات" تحت خيار "تحليل" من شريط الأدوات "تجربة إكسبلورر" على اليسار من screen.Choose "تايم" تحت عنوان "تداخل" سption في شريط الأدوات "مكونات". ضبط "إلى" ب "0:02:00" تحت عنوان "تحديد المسار الفاصل الزمني" العنوان في مربع الحوار "تايم". انقر على زر "موافق".
26. اسحب مربع "عش" بين مربع "ابدأ" وصندوق "النتيجة 1" في منطقة "ملفات البيانات" على الجانب الأيمن من الشاشة. انقر على "الملف الشخصي تحليل" تحت خيار "تحليل" من شريط الأدوات "تجربة إكسبلورر" على يسار الشاشة. انقر على "سرعة" تحت "المسافة والوقت" العنوان في شريط الأدوات "المتغيرات التابعة" التي تظهر.
27. انقر على "أضف" في مربع الحوار "السرعة". انقر على "انتقلت بعد" تحت "المسافة والوقت" العنوان في شريط الأدوات "المتغيرات التابعة". انقر فوق "إضافة" على "انتقلت بعد" مربع الحوار. انقر على "حركة" تحت عنوان "السلوك الفردي" تسير في "المتغيرات التابعة" تيoolbar.
28. ضبط "فاصل متوسط" إلى "1" تحت عنوان "تصفية ناشز" العنوان في مربع الحوار "حركة". ضبط "ابدأ السرعة" إلى "2.00" و "أوقفوا السرعة" إلى "1.75" تحت عنوان "عتبة" العنوان في مربع الحوار "حركة".
29. تحقق كل المربعات ل"نقل" و "لا تتحرك" تحت عنوان "حساب إحصاءات" العنوان في مربع الحوار "حركة". انقر على "أضف" في الجزء السفلي من مربع الحوار "حركة". انقر على "الناتج تحليل" تحت خيار "نتائج" في شريط الأدوات "تجربة إكسبلورر" على يسار الشاشة. انقر على "حساب" في أعلى الشاشة.
30. مرة واحدة يتم احتساب المتغيرات التابعة، انقر فوق "تصدير" في أعلى الشاشة. اختيار المجلد الوجهة في "إخراج تحليل تصدير" مربع الحوار. حدد "إكسل" من "نوع ملف" القائمة المنسدلة في "تصدير تحليل تبور "مربع الحوار. انقر على" موافق ".
31. انقر على "حفظ تجربة" تحت علامة التبويب "ملف" في الجزء العلوي من الشاشة. إغلاق تتبع البرامج الرقمية. استيراد البيانات إلى ملف البيانات وتحليلها باستخدام الإحصائية حزمة برامج التحليل التجارية.

Representative Results

تجهيز يدويا وأظهرت بيانات الرصد البصرية تشوهات في المئة زيادة مع زيادة تركيز النحاس بعد مجرد 72 ساعة من التعرض بدأت مع 2 يوم آخر يفقس (الفقس) سمك الحفش (الشكل 2). توثيق العينات الفيديو الأثر الشديد من التعرض النحاس على سلوك السباحة سمك الحفش (فيديو 2) وساعدت في تحديد ضعف السلوكية نتيجة لذلك. وفي مثال آخر، سمك الحفش في 30 الفقس أثبت حساسية للتعرض النحاس مع 96 ساعة متوسط ​​تركيز التأثير المميت (LC50) من 40.3 ميكروغرام / لتر وذلك استنادا فيات فقط. ومع ذلك، عندما يتم تضمينها النهاية السلوكية شبه مميتة من فقدان التوازن والشلل جنبا إلى جنب مع وفيات يزيد حساسية مع 96 ساعة تركيز تأثير متوسط ​​يقدر ب (EC50) تتراوح 2،4-5،0 ميكروغرام / لتر. وثائق الفيديو التي تم التقاطها هذه الآثار شبه مميتة ومواصلة التحقق من صحة الملاحظات الإنسان من الانحرافات السلوكية سجلت خلال التعرض. استخدام تتبع البرامج الرقمية تخفيض وقت المعالجة وآخر بشكل ملحوظ عند تحليل نشاط السباحة. سرعة السباحة الأسماك، أمضى وقت التحرك، والمسافة المقطوعة انخفض بشكل ملحوظ عن (الشكل 3) مع زيادة تركيز النحاس. خفضت مسارات السباحة أيضا مع زيادة تركيز النحاس (الشكل 4).

الشكل 1:.. قطة شاشة الحاسوب من قالب جدول المستخدمة لتحديد اختبار تركيز الأسهم حل إعداد الأوراق المالية الكيماوية للتم تحديد باستخدام قالب جدول بيانات على أساس تركيز الهدف من اختبارات السمية مخففة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في الصفحة = "1">
تعرضت الإعداد مخففة والتصميم التجريبي مختلفة الحياة مراحل سمك الحفش الأبيض النحاس: الرقم 2. وقد تم اختيار حجم مخففة المستخدمة في التعرض على أساس حجم الأسماك. تعرضت (أ) سمك الحفش في وقت مبكر من مرحلة الحياة باستخدام الإعداد مخففة صغير و (ب) سمك الحفش القديمة الحياة المرحلة تعرضوا باستخدام الإعداد مخففة كبير.

الشكل (3): السباحة النتائج السلوك من المراحل الأولى من حياة سمك الحفش الأبيض (أسيبنسر ترانسمونتانوس) 72 ساعة من التعرض النحاس (بدءا من 30 يوم آخر يفقس [الفقس] الأسماك). النهاية نشاط السباحة (أ) مدة التنقل بين 30 الفقس سمك الحفش الأبيض. (ب) سرعة السباحة. و (ج

الشكل 4: النتائج من المراحل الأولى من حياة سمك الحفش الأبيض (أسيبنسر ترانسمونتانوس) بعد 96 ساعة من التعرض النحاس (بدءا من يوم 2 آخر يفقس [الفقس] الأسماك) على قيد الحياة سمك الحفش الأبيض في 2 الفقس العارضة فقدان التوازن والشلل بعد 72 ساعة من ذلك. تعرض 96 ساعة مع زيادة تركيز النحاس. النجمة تشير فرق كبير من السيطرة، وأشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري.

الشكل 5: مثال السباحة النتائج مسار من سمك الحفش الأبيض المراحل الأولى من الحياة (أسيبنسر transmontanus) بعد 96 ساعة من التعرض النحاس (يحدق مع 30 يوم آخر يفقس [الفقس] الأسماك). مسارات السباحة سمك الحفش الرقمية باستخدام برنامج تتبع الرقمي من (أ) تكرار التحكم (ن = 5 الأسماك) و (ب) من العلاج عالية (50 ميكروغرام / لتر) مكرر (ن = 3 السمك) بعد تعرض 96 ساعة. لاحظ عدد من مسارات السباحة لا يمثل عدد من الأسماك الموجودة في الغرفة بسبب بعض الأسماك كانت غير نشطة. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

معلمة قابلة للقياس الكمي	معلمات الرصد
سرعة	الخمول / فرط النشاط
المسافة منقول	فقدان التوازن
مدة الوقت المخصص للمنطقة	تشنجات / الهزات / رأسا على عقبأسفل
منطقة انتقالية عدد من التحركات كائن مرات بين مناطق مختارة	موقف في عمود الماء
التوجه الى نقطة بحساب انحراف مسار الحيوان نحو نقطة من الفائدة	التنفس (سريع / بطيء)
العنوان يحسب عنوان نقطة الجسم المختارة	تلوين
تحويل زاوية اختلاف في التوجه بين عينتين	إخفاء
بقسمة زاوية بدوره من قبل الفاصل الزمني العينة الزاوي يحسب سرعة-
تسكع-بقسمة زاوية بدوره من مسافة نقلها. يستخدم لمقارنة تحول في الحيوانات تتحرك بسرعات مختلفة
قضى وقتا تتحرك
التنقل دولة بحساب المدة التي المنطقة كاملة الكشف عن الحيوان يتغير، حتى لو كان المائةنقطة إيه لا يزال هو نفسه
اكتمال دوران واحد تناوب عند نقطة الجسم مختارة لديها زاوية بدوره التراكمية من 360 درجة. تدور في الاتجاه المعاكس من أقل من عتبة يتم تجاهل.
التنقل المستمر بحساب النسبة المئوية للتنقل للمنطقة كاملة من الحيوان الكشف، حتى لو كانت نقطة المركز لا يزال هو نفسه.
المسافة بين الموضوعات بحساب المسافة بين كل الأطراف الفاعلة واستقبال المختارة
القرب، وتحسب المدة التي الفاعل هو أو ليس في القرب إلى المتلقي
الحركة النسبية
صافي حركة المرجحة حركة الممثل إلى (إيجابية)، ومن (سلبي) المتلقي، مرجحة المسافة بينهما
حركة المرجحة من-moveme الإقليم الشمالي من الفاعل من المتلقي، مرجحة المسافة بينهما.
حركة المرجح ل- حركة الممثل إلى المتلقي، مرجحة المسافة بينهما
مراقبة محاكمة فترة الوالية بين حدثين من عناصر تحكم المحاكمة، أو في عنصر واحد
مراقبة محاكمة الحدث لحظة والذي حدث داخل العنصر الذي حددت في مراقبة محاكمة يحدث.

الجدول 1: النهاية السلوكية كميا من خلال تتبع البرامج الرقمية هذه النهاية يمكن استخدامها على الأفراد أو الجماعات وأيضا بمثابة قائمة لاجراء فحوص المراقبة البصرية السلوكيه ضعف خلال التعرض.

/www.jove.com/files/ftp_upload/53477/53477video1.avi "> فيديو ^1: تعريف مرئي من السلوك الشاذ التي أظهرتها سمك الحفش الأبيض المتضررين (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل) تم استخدام قائمة الاختيار المراقبة اليومية لتوثيق حالات الشذوذ و. وكانت خسارة التوازن والشلل والتشوهات الأكثر انتشارا لوحظ خلال التعرض. معدلة من Calfee وآخرون. ⁷

فيديو 2: البصرية وثائق تسليط الضوء على مثال السلوك السباحة سمك الحفش الأبيض. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل) تم تخفيض النشاط السباحة سمك الحفش الأبيض إلى حد كبير مع التعرض لزيادة تركيز النحاس. سمك الحفش هو مبين في هذا الفيديو هم من عنصر تحكم، وانخفاض المتوسط، وعلاج ارتفاع في نهاية 96 ساعة النحاس مائيالتعرض. على الرغم من أن سمك الحفش الأبيض كان لا يزال على قيد الحياة فمن الواضح الأسماك وأعاق بشكل كبير في العلاجات مقارنة مع الضوابط. تعديل من Calfee وآخرون. ⁷

Discussion

وغالبا ما تستخدم التغييرات في السلوك بسبب التعرض لملوثات باعتبارها نقطة النهاية لسمية شبه قاتلة، ولكن يمكن أن يكون من الصعب قياس. عموما، يتم قياس ردود السلوك حسب الملاحظات البصرية وتحليل البيانات يدويا الأمر الذي يتطلب الكثير من الوقت لمعالجة. ولكن مع تقدم التكنولوجيا، وركزت وسائل للنشاط السباحة قياس على استخدام بالفيديو ¹⁸ و تحليل الحركة أو تتبع البرامج الرقمية مما يقلل من الوقت اللازم لتجهيز والتحليل. خلال تحليل الفيديو التي تم التقاطها البيانات، قياس المتغيرات السباحة يمكن أن يكون الوقت ذاته يدويا المستهلكة وبالتالي فإن استخدام تسجيلات الفيديو والبيانات تتبع البرامج الأسماك المقدمة بطريقة أكثر فعالية وكفاءة لتحليل سلوك السباحة سمك الحفش. على الرغم من أن الإجراء أبرز السباحة سلوك الأسماك، وتكييف للكائنات الحية الأخرى مثل البرمائيات واللافقاريات المائية سيتطلب تعديلات بسيطة. اعتمادا على ما endpoin السلوكيةيتم تناول الخبر، ويمكن تطوير تصميم وكاميرا النظم التجريبية للاستخدام مع عادل عن أي متوفرة تجاريا حزمة برامج تتبع.

ويتجلى في طريقة استخدام النحاس المذاب، ولكن ينطبق على ملوثات أو خصائص مثل درجة الحرارة أو محتوى الأكسجين المائية الأخرى. البروتوكولات وضعت وقدم في هذه الورقة استخدمت بسيطة كاميرا الفيديو الرقمية وجهاز التسجيل. ونقل الملفات الرقمية بسهولة إلى جهاز الكمبيوتر وتحميلها الدخول إلى برنامج تحليل الحركة. يجري باستمرار تعديل الأساليب وصقلها لتبسيط عملية القياس الكمي. لا بد من أن جودة الفيديو تكون عالية الوضوح من أجل برامج التحليل للتعرف على كل الأسماك الفردية لتتبع. فإن أي الخلفية التي لا تتناقض مع السمك يسبب مشاكل عند محاولة معالجة ملفات البيانات. مشكلة مشتركة أخرى مع اثنين من تتبع الفيديو الأبعاد هي تحديد الأفرادعند عبور مسارات السباحة. هذا يمكن تصحيحها يدويا عن طريق تحديد كل الأسماك أثناء عبور الطريق وربط قطاعات مسار داخل البرنامج. بدلا من ذلك، النشاط الكلي يمكن أن تحدد من كل غرفة تكرار كمتوسط ​​المجموعة. عدة غرف فردية مع كل واحدة تحتوي على الأسماك واحد يمكن أن يتم تصويره في نفس مجال الرؤية لحساب حركات الأسماك الفردية.

حاليا لدينا ورفع مستواها لباستخدام سلسلة من كاميرات المراقبة العامة فوق غرف التعرض التي ترتبط عالية الوضوح جهاز تسجيل الفيديو الرقمي (DVR-HD). ومع ذلك، فإن استخدام أي نظام الكاميرا التي يمكن أن تسجل عالية الوضوح MPEG-4 أشرطة الفيديو يعمل. وHD-DVR يمكن تعيين لتسجيل في وقت محدد ومبرمجة لمدة تصل إلى 7 أيام. هذا والتلقائية الآلي يسمح القبض على العديد من أشرطة الفيديو في نفس الوقت للحفاظ على الاتساق مع التقليل من الاضطرابات الخارجية التي يمكن أن تضر سلوك الأسماك. التنفسي HD-DVRترتبط مللي ثانية إلى الشبكة الداخلية حتى نقل الملفات هي بسيطة نسبيا. في حين أن نظام الكاميرا الآلي هو تحسين تقنية الكثير لقياس سلوك السباحة، فإنه لا يزال من المفيد إجراء الملاحظات البصرية لخدمة المعلومات الداعمة كما إضافية لتوثيق ضعف السلوكي خلال اختبارات السمية.

وهناك تاريخ طويل من الأدب توثيق سلوك الأسماك غيرت الناتجة عن التعرض للمعادن التي يعود تاريخها إلى أوائل 1960s ^19،20،21. وقد تبين النحاس تسبب تغيرات في مستويات النشاط مثل قصور النشاط في الخيشوم ²² (Lepomis macrochirus rafinesque) والتغيرات في الحركي والنشاط تغذية من سمك السلمون المرقط تحتمل ²³ (Salvelinus fontinalis). على الأقل تعتمد بعض الأسماك الصغيرة على حاسة الشم لكشف وتجنب الحيوانات المفترسة، والحرمان حسي كيميائي الناجم عن النحاس قد يؤثر السلوكيات المتعلقة الكشف عن المواد الكيميائية إنذار ^24،25،26 27. وكانت هذه السلوكيات تتغير متسقة مع ما لوحظ خلال التعرض.

وقد أثرت على سلوك السباحة من سمك الحفش الأبيض إلى حد كبير خلال التعرض لتركيزات دون المميت النحاس المائية .. هذه النتائج توضح كيف يتأثر سلوك بتركيزات دون المميتة من النحاس، ويمكن استخدامها كمؤشر على التوتر السامة. أثبت التحليل القائم فيديو فعال في قياس السلوك السباحة ويقدم أيضا وثائق بصرية النوعية من آثار وخيمة على سمك الحفش معرضة لالنحاس. برامج التحليل هو أيضا قادرة على قياس النهاية السلوكية المختلفة الأخرى. يرجى الرجوع إلى الجدول رقم 1 للحصول على قائمة. تعرض النظام يمكن تعديلها لمعالجة كل نقطة النهاية فيالوضع في الوقت الحقيقي، ويمكن استخدامها لتحديد الاختلافات في السلوك المصاحبة للتعرض للملوثات المختلفة للقلق.

استخدام نقاط النهاية السلوكية في مجال البحوث السمية المائية يعمل على نحو متزايد، وينبغي أخذها في الاعتبار عند تقييم آثار الملوثات لأن وظيفة السلوكية التكيفية حاسمة في تحديد الضرر البيئي ^9. آثار الملوثات البيئية لسلوك الأسماك في كثير من الأحيان غير موضوعية وتحديا من نوع خاص عند التعامل مع النهاية دون المميتة في غياب الأساليب القياسية ..

السباحة النشاط كما كميا باستخدام هذه الأساليب يمكن رصدها بدقة، هو غير مدمرة مع الحد الأدنى من الضغط على الكائن الحي ويمكن أن تتكرر. السباحة السلوك هو مؤشر صالح وثابت من سمية مميتة التي ينبغي إدخالها على بروتوكولات اختبار لتوسيع حساسية من اختبارات السمية القياسية ^5.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
copper II sulfate pentahydrate	Sigma-Aldrich		contaminant of concern
syringe dispenser	Hamilton MicroLab 600 Series		apparatus to spike chemical
2 L volumetric flask			container for holding stock solution
24-1.5 L glass jars			test chamber for 2 dph sturgeon
video camera	Sony Handycam HDR-CX550V
digital tracking software	Noldus Ethovision
3-17" flat screen monitors
24 surveillance cameras	Model CL101
3-16 channel digital recording devices
DO meter	YSI
pH meter	Orion 940
ph probe	Orion
ammonia meter
ammonia probe	Orion
chiller unit
recirculating water pump