Name: 不良反应风险低的大鼠前房内注射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: 学习大鼠前房内注射技术，采用长隧道角膜切口法精准递送药物至前房，降低组织损伤风险。该方法通过手术显微镜操作，提高实验可重复性，适用于眼科疾病模型构建及药物评估研究。

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本研究由以色列科学基金会资助，资助编号为2670/23和1304/20。

本方案中的实验已获得国家动物科学许可委员会批准，并符合ARVO关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明。本研究使用8至10周龄的雌性Sprague-Dawley大鼠，动物处于12小时光照/12小时黑暗的循环环境中。实验动物购自商业来源（见材料表）。
1. 动物准备
<ol>
	<li>配制氯胺酮（80 mg/kg 体重，0.8 mL）和赛拉嗪（4 mg/kg 体重，0.2 mL）的麻醉混合液，并通过单次腹腔注射对大鼠进行麻醉。</li>
	<li>通过单次腹腔注射给予镇痛剂丁丙诺啡（0.03 mg/kg）。</li>
	<li>将0.4%奥布卡因局部眼用麻醉剂滴于双眼。</li>
</ol>
2. 创建自密封角膜隧道
<ol>
	<li>使用眼科手术镊夹住角膜缘旁垂直中线处的上方巩膜，以固定眼球。</li>
	<li>在手术显微镜下，将无菌的0.8 mm、31 G刀头的柳叶刀置于中央角膜区的垂直中线上（瞳孔中心上方），刀片保持平放，角度尽可能接近水平（图2）。</li>
	<li>在此位置刺穿角膜，制作切口并形成一个长隧道（2–3 mm），直至进入前房中央区域。避免接触晶状体（图2）。 
	注意：成功的隧道切口不会引起房水渗漏，也不会导致前房变浅。</li>
	<li>对注射眼局部使用0.3%氧氟沙星和0.1%地塞米松。</li>
	<li>按以下步骤进行裂隙灯显微镜检查。
	<ol>
		<li>观察注射眼与未注射眼的前房深度是否一致。 
		注意：前房深度应相似。</li>
		<li>观察注射眼与未注射眼的晶状体情况。 
		注意：晶状体应透明。混浊可能提示手术过程中晶状体受损。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="显示角膜切口的眼科手术示意图；标签指示晶状体、前房和刀片位置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66662/66662fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：刀片及切口角度与位置的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66662/66662fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
3. 选项1：前房内注射台盼蓝以评估注射是否成功进入前房
<ol>
	<li>用无菌的10 µL玻璃Hamilton注射器（带34 G钝针头）吸取5 µL台盼蓝。 
	注意：在模型校准或建立阶段，注射台盼蓝可用于评估注射是否成功。在正式实验中，注射器内可装载所选化合物的溶液。</li>
	<li>将装有液体的注射器针头经第2节中创建的隧道插入前房。</li>
	<li>注射后保持针头位置不动2-3秒，直至所有液体完全弥散。</li>
	<li>缓慢轻柔地拔出针头，以避免角膜隧道处发生渗漏。</li>
	<li>在裂隙显微镜下进行检查，评估前房深度以排除变浅情况，并确认前房内存在台盼蓝。</li>
	<li>分别在24小时、48小时和72小时后重复裂隙灯检查。</li>
</ol>
4. 选项2：通过Hoechst眼内注射评估注射物质对内皮细胞层的生物利用度
<ol>
	<li>将5 µL Hoechst加入无菌的10 µL玻璃Hamilton注射器中，并安装34 G钝头针。 
	注意：注射Hoechst用于评估注入物质的生物可利用性，通过观察其在内皮细胞层中的摄取情况，在模型校准或建立阶段具有参考价值。在实验条件下，注射器中可装载所选化合物的溶液。</li>
	<li>将装有试剂的注射器针头穿过第2节中创建的隧道，插入前房。</li>
	<li>注射后保持针头位置不动2–3秒，直至所有液体完全排出。</li>
	<li>缓慢轻柔地拔出针头，以避免角膜隧道切口处发生渗漏。</li>
	<li>注射后约15–20分钟，通过腹腔注射500 mg/kg戊巴比妥钠处死大鼠。</li>
	<li>摘除双眼并分离角膜。将未注射侧角膜作为对照样本保存。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用0.5%茜素红S对两侧角膜进行染色，以识别内皮细胞。</li>
	<li>在光学显微镜下观察茜素红S染色的内皮细胞成像，并在荧光显微镜下观察Hoechst染色情况，以未注射侧角膜作为对照进行比较。</li>
</ol>

Optimized Rat Intracameral Injection Technique for Reduced Tissue Damage

<ol><li>Ramsay, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+and+conjunctival+drug+permeability%3A+Systematic+comparison+and+pharmacokinetic+impact+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Corneal and conjunctival drug permeability: Systematic comparison and pharmacokinetic impact in the eye.</a> Eur J Pharm Sci. 119, 83-89 (2018).</li>
<li>Cholkar, K., Dasari, S. R., Pal, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCholkar%2C+K+%22Eye%3A+Anatomy%2C+Physiology+and+Barriers+to+Drug+Delivery.+Ocular+Transporters+and+Receptors%22">Eye: Anatomy, Physiology and Barriers to Drug Delivery. Ocular Transporters and Receptors</a>. , Elsevier, Woodhead Publishing. (2013).</li>
<li>Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+cornea%2C+sclera%2C+and+conjunctiva%3A+A+literature+analysis+for+drug+delivery+to+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Permeability of cornea, sclera, and conjunctiva: A literature analysis for drug delivery to the eye.</a> J Pharm Sci. 87 (12), 1479-1488 (1998).</li>
<li>Varela-Fernández, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+to+the+posterior+segment+of+the+Eye%3A+Biopharmaceutic+and+pharmacokinetic+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Drug delivery to the posterior segment of the Eye: Biopharmaceutic and pharmacokinetic considerations.</a> Pharmaceutics. 12 (3), 269(2020).</li>
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<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+rat+model+of+ocular+hypertension+by+a+single+intracameral+injection+of+cross-linked+hyaluronic+acid+hydrogel+%28Healaflow%C2%AE+%29%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Clin+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">A novel rat model of ocular hypertension by a single intracameral injection of cross-linked hyaluronic acid hydrogel (Healaflow® ).</a> Basic Clin Pharmacol Toxicol. 127 (5), 361-370 (2020).</li>
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</ol>

Marcovich A. L. 在 Steba Biotech、Yeda Weizmann、EyeYon Medical 和 Mor Isum 拥有专利，并担任 EyeYon Medical 和 Johnson &amp;#38; Johnson 的顾问。其他所有作者均无利益冲突。

临床前研究模型应提供一个受控且可重复的环境，以确保研究结果的可靠性和适用性。在眼科研究中，眼内注射模型常用于多种研究领域，包括建立疾病模型、测试新疗法以及评估组织反应和潜在不良反应。
前房注射是实验眼科学中常用的技术，可通过绕过角膜外组织屏障，将化合物直接递送至房水中5。这种通过前房注射实现的靶向给药方式，可确保药物以最佳浓度到达预定作用部位，如晶状体、小梁网或角膜内皮细胞，从而最大化治疗效果。
在小型啮齿类动物中进行前房注射存在多项技术挑战，可能影响实验的可重复性与成功率。首先，啮齿类动物眼球尺寸较小，难以在不损伤眼内结构的前提下实现有效进入和操作。在此方面，大鼠因其眼球较大，相较于小鼠具有一定优势。其次，晶状体位于空间受限的前房内，可能阻碍通往注射部位的路径。与其他哺乳动物（包括人类）相比，大鼠的晶状体较为突出或显著，这与其相对于眼球的较大尺寸有关（图1）。此外，大鼠晶状体缺乏人类晶状体所具有的弹性。因此，必须谨慎操作注射针头，以绕过晶状体并避免造成损伤。
操作过程中造成的组织损伤可能导致多种并发症，包括前房变浅、眼内压升高、炎症或前葡萄膜炎、内皮细胞损伤、白内障形成、其他结构改变或畸形，以及感染风险。这些挑战凸显了在小型啮齿类动物模型中进行前房注射时，需要采用精确的技术，并仔细考虑解剖学差异。
本方案中所述的前房内注射技术旨在最大限度地降低注射过程中对眼组织造成损伤的风险。该方法通过建立一个自封闭的隧道进入前房，从而以最小的摩擦阻力实现顺利进入。切口的良好封闭性对于降低术后低眼压和液体渗漏风险、防止眼睑和睫毛来源的微生物感染至关重要。切口的角度和长度均对伤口力学特性、不良反应的发生以及后续恢复过程具有关键影响。过大的切口可能导致视轴混浊，并诱发角膜条纹或水肿，而过短的切口则可能使前房不稳定并导致虹膜脱出。以接近角膜平面轴线的角度进行切口，可在避免相关风险的同时形成较长的单平面隧道。重要的是，通过引导形成的长隧道将针头穿入前房可提高操作精度，降低意外接触晶状体的可能性。此外，与人类注射通常选择周边切口不同，大鼠的隧道切口位于中央角膜处，此处前房最深。实验验证证实，该方法可实现注射过程中无房水渗漏或前房变浅现象，且不会触碰晶状体。
既往研究描述了多种大鼠前房注射的方法。例如，Rosenstein 团队在多项研究中描述了通过角膜缘进行前房注射的技术。注入 20 µL 液体可逐步增加前房深度，从而使针头远离虹膜，有助于避免针头接触晶状体。注射的副作用包括一过性角膜水肿以及约 5% 的白内障发生率14,15,16。Matsumoto 等人描述了一种在大鼠中进行前房内微珠注射以建立青光眼模型的技术。作者采用单步切口法，使用 34 G 针头制作巩膜角膜隧道，并将针头斜面向上插入前房。作者报告称可避免触碰角膜或虹膜，未观察到炎症事件，仅在少数情况下（&#60;7% 的受检动物）注射过程中损伤了内皮层。然而，作者指出，仅采用这种改良注射方法尚不足以有效防止前房内液体大量渗漏及反流至结膜下间隙。为克服这一问题，注射了 20 µL 微珠与分散性眼用粘弹剂（OVD；Viscoat）的混合物。该方法使眼内压（IOP）显著升高，并可持续至注射后 4 周17。类似地，Liu 等人描述了使用 32 G 针头沿角膜缘平行于虹膜方向插入前房进行前房内注射的技术，从而形成自闭合的角膜隧道18。作者注射了 3 µL 透明质酸钠水凝胶，并使用棉签压迫注射部位以尽量减少前房液体外漏。该高分子量凝胶被描述为可在前房内滞留，并阻断房水经小梁网流出18。值得注意的是，本文所述的改良前房注射方法无需使用粘弹性物质即可完成注射，因此适用于广泛的科研应用。然而，由于本研究仅限于注射体积不超过 5 µL 的液体溶液，针对特定研究目的，应针对不同注射方法及注射材料进行精确比较，以确定最适宜的技术。
前房内注射的临床应用广泛多样。例如，在白内障手术期间，前房内给予皮质类固醇和抗生素（如头孢呋辛和莫西沙星）是常见的预防措施，用于防止术后感染和眼内炎19,20,21,22,23,24,25。在常规白内障手术中，眼内给药也用于局部麻醉和散瞳26,27。此外，青光眼的治疗涉及多种通过前房给药以降低眼内压的药物，例如前列腺素类似物或毒蕈碱受体激动剂，它们可增加房水流出；抗纤维化药物如丝裂霉素C，用于防止瘢痕形成和纤维化；以及抗血管内皮生长因子（anti-VEGF）药物，用于治疗新生血管性青光眼28,29,30。这一系列多样的前房内治疗方法体现了其在应对多种眼科疾病和改善患者预后方面的重要作用。
本文所述的前房注射方法将有助于推进前房注射广泛临床应用的各种临床前研究。例如，在大鼠模型中采用前房注射来确定各种药物的有效性、最佳剂量、给药时机及长期疗效，是进入临床试验前至关重要的初步步骤。在这些研究中，提高注射技术的精确性和可重复性，是实现研究成功与顺利推进的关键。
此外，通过向眼前房递送载体或化学物质，所述的前房内注射方法可用于构建不同眼部疾病的实验模型。此类实验模型对于研究疾病机制和开发新疗法至关重要。例如，福克斯内皮营养不良（Fuchs' endothelial dystrophy, FED）是一种导致视力逐渐下降的进行性角膜疾病，目前尚无治愈手段31。主要的临床管理措施包括病情监测以及对症治疗，通常使用局部药物以暂时缓解水肿或润滑眼球。当疾病进展或出现严重视力障碍时，角膜移植（内皮角膜移植术）便成为必要的干预手段。因此，开展旨在为FED开发新治疗方案的研究具有重要意义，有望为角膜移植提供替代性治疗选择。鉴于通过角膜或结膜途径给药时药物生物利用度有限1,2,3，前房内给药成为治疗角膜内皮层的一种优势途径。前房内注射的实验模型在开发FED新型治疗方法中发挥着关键作用。采用本文所述的前房内注射方法，可促使注射物质被角膜内皮层有效摄取。将该方法应用于前房内注射，能够以高精度和良好重复性建立FED治疗的实验模型。这不仅有助于深入理解FED的病理机制，也为开发靶向性强且有效的治疗干预措施开辟了新途径。
综上所述，本文介绍了一种针对大鼠的优化前房注射方案，其不良反应风险较低，有助于提升眼科临床前研究水平，并为眼病治疗新方法的开发提供支持。

局部给药至眼表的化合物生物利用度通常极为有限 &lt;5%1滴眼液给药的化合物主要通过引流、刺激性泪液分泌、泪液更新以及结膜吸收等方式被清除。此外，角膜-结膜屏障极大地限制了化合物透过眼表的渗透。1,2,3角膜由三层主要结构组成：最外层的上皮层、中间的基质层和最内层的内皮层。表层角膜上皮细胞之间通过紧密连接相互连接，形成较高的细胞旁通路电阻，构成物质通透的主要屏障。多层上皮结构进一步限制了亲水性及大分子物质通过角膜上皮细胞间隙的渗透。紧接上皮层之后的基质层由胶原纤维构成，并含有水性孔隙。与角膜上皮不同，基质层允许亲水性药物通过；然而，其对脂溶性化合物则具有显著的低通透性。1,2,3角膜上皮层和基质层共同构成了限制药物吸收的主要组织屏障。角膜内皮层通常不被视为限制药物转运的因素。
除角膜给药途径外，结膜途径也是一种选择。结膜是一种多层上皮组织，覆盖于眼睑内侧表面及巩膜前部。与角膜上皮相比，结膜的紧密连接较少，因而对亲水性药物具有更高的通透性。然而，结膜具有血管化特征，导致大部分给药分子被系统性吸收，从而再次显著限制了药物在前房中的生物利用度1,2。一种有效绕过眼部外层通透性屏障的方法是将药物直接递送至目标区域。例如，玻璃体内注射常用于向玻璃体腔内递送药物4。同理，前房内注射则用于将药物递送至前房5。在前房中建立有效的药物浓度对于多种临床情况至关重要，例如通过前房内注射抗生素治疗感染，以及白内障手术后的抗炎治疗。尽管前房内注射可提高药物的生物利用度，但仍存在重要的安全性问题需要考虑。例如，前房内药物注射可能引起眼内压升高、毒性前段综合征以及毒性内皮细胞破坏综合征5,6。因此，在临床前研究中必须仔细评估前房内注射药物的疗效与安全性，以最大化治疗效果，并将患者潜在的不良反应降至最低。
在临床前研究中，实验动物模型对于探索新疗法至关重要。小啮齿类动物（如小鼠和大鼠）是此类研究中最常用的实验动物。这些动物在解剖学和生理学方面与人类具有诸多相似之处，可提供重要的研究信息。此外，由于其体型小、易于饲养、妊娠周期短且繁殖能力强，使用这些动物具有显著的经济优势7。
尽管小型啮齿类动物在眼病模型中被广泛使用，但其独特的眼部尺寸和解剖结构在实验操作中带来了显著挑战。例如，在人类中相对简单的前房注射操作，在小鼠和大鼠中却具有较高的技术难度。这些困难主要源于房水体积小、晶状体相对较大且缺乏弹性，以及晶状体在啮齿类动物眼内的位置和曲率造成的阻碍（图1）8。这些因素增加了在啮齿类动物中进行前房注射时造成损伤的风险，可能导致不良反应，并引入实验变异性，从而影响研究结论的可靠性。在我们的研究中，已成功建立了一种在大鼠中安全实施前房注射的操作方法。该技术通过在角膜上构建一条长而平坦、可自行闭合的隧道通向前房。该方法不仅确保了操作的精确性，还提高了实验的可重复性，有效解决了小型啮齿类动物注射技术中的相关问题。
<img alt="眼睛解剖结构比较示意图：大鼠与人类；晶状体、虹膜、角膜标注，用于教学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66662/66662fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：大鼠与人类眼球前段解剖结构特征的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66662/66662fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>茜素红&amp;nbsp;</td><td>Alpha Aesar</td><td>042040.5</td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡&amp;nbsp;</td><td>Richter pharma</td><td>102047</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松 0.1%&amp;nbsp;</td><td>Fisher Pharmaceutical</td><td>393102-0413</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 玻璃注射器 10 &amp;mu;L&amp;nbsp;</td><td>Hamilton Co.</td><td>721711</td><td></td></tr><tr><td> Hoechst </td><td>Merck</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Bremer pharma GMBH (medimarket)</td><td>17889</td><td></td></tr><tr><td>0.3% 氧氟沙星滴眼液</td><td>Allergan</td><td>E92170</td><td></td></tr><tr><td>盐酸奥布卡因 0.4%&amp;nbsp;</td><td>Fisher Pharmaceutical</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠 200 mg/mL</td><td>CTS</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>裂隙显微镜&amp;nbsp;</td><td>Haag-streit bern</td><td>b-90019115</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley 大鼠</td><td>Envigo</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stiletto 刀片 31G 0.8 mm&amp;nbsp;</td><td>Tecfen medical (skymed)</td><td>QKN2808</td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>Zeiss</td><td>OPMI-6 CFC</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sartorius</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Eurovet Animal Health&amp;nbsp;</td><td>615648</td><td></td></tr></tbody></table>

大鼠眼内注射技术：低不良反应风险

Intracameral Injection in Rats with Low Risk of Adverse Effects

前房注射是眼科领域的一种标准给药方式。由于啮齿类动物眼部结构尺寸有限，包括房水体积小、晶状体曲率及晶状体厚度等因素，将其应用于科研中的前房注射操作具有挑战性。前房注射过程中可能造成的眼部损伤会引发不良反应并增加实验变异性。本方案介绍了一种在大鼠中实施前房注射的操作流程，可实现高精度和可重复性。
Sprague-Dawley大鼠被用作实验模型。由于大鼠晶状体位置突入前房，若采用与人类相同的方式从周边部注射，则操作不利。因此，使用31号0.8 mm尖刀在角膜中央区域制作切口，形成可自封闭的隧道通向前房。在角膜中央区域制作切口&#160;接近平角的角度可形成较长的隧道，从而最大限度减少房水丢失和前房变浅。将34G纳米针插入隧道内进行注射，可实现低摩擦阻力穿透，并避免接触晶状体。注入台盼蓝可&#160;可视化&#160;通过裂隙灯显微镜观察前房内染料的存在，并排除渗漏。通过注射Hoechst染料显示角膜内皮层的生物可利用性，染料注射后可对角膜内皮细胞核进行染色。
综上所述，本方案建立了一种在大鼠眼前房内进行精确注射的操作流程。该方法可用于在实验性大鼠模型中向眼前房递送多种药物和化合物，从而提高眼科研究的效率与可重复性。

根据上述方案，向Sprague Dawley大鼠前房内注射5 µL台盼蓝。注射后立即进行裂隙灯检查，结果显示前房被台盼蓝染色，表明注射物质已到达前房（图3）。此外，前房深度保持正常，提示注射未导致房水外漏或前房变浅。
<img alt="显微镜下的眼部解剖结构；眼球结构，毛细血管细节，细胞研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66662/66662fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：前房内注射后完整的眼前房结构。将台盼蓝注入大鼠眼前房。裂隙显微镜检查显示台盼蓝存在于前房内，无渗漏或前房变浅现象。比例尺 = 1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66662/66662fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
接下来，注射Hoechst——一种可穿透细胞膜的荧光染料，能够结合DNA并染色细胞核，用于评估通过所述前房注射途径递送药物的生物可利用度。注射后15分钟，通过分离角膜并在荧光显微镜下观察，评估内皮细胞对Hoechst的摄取情况。为了识别内皮细胞，使用茜素红S对角膜进行染色，该染料可标记内皮细胞层的细胞间边界。作为对照，我们检测了同一只大鼠的未注射眼。结果显示，注射后内皮细胞层保持完整，表明所述操作不会对内皮造成损伤。此外，内皮细胞显示Hoechst核染色阳性，证明通过前房注射后，Hoechst被内皮细胞成功摄取（图4）。
<img alt="茜素红、Hoechst 染色及合并图像的细胞染色比较；显微镜技术。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66662/66662fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：前房内注射物质对内皮细胞层的生物可利用性。将 Hoechst 注入大鼠前房。注射后 15 分钟取下角膜，用茜素红 S 染色以观察内皮细胞，并在荧光显微镜下成像以检测 Hoechst 染色情况。叠加图像显示角膜内皮细胞核的 Hoechst 染色。比例尺 = 50 µM。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66662/66662fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了一种通过中央角膜切口和长隧道进入前房的大鼠前房注射技术。该注射方法可最大限度地降低意外组织损伤的风险，从而提高操作的精确性和可重复性。

前房注射是眼科临床中的标准给药方式。在科研中，将前房注射应用于啮齿类动物尚属……

前房注射可绕过眼球外层屏障，将化合物直接递送至房水中。然而，在啮齿类动物中进行前房注射存在技术上的挑战，可能导致不良反应并影响实验结果。因此，我们根据大鼠眼球的解剖结构设计了本实验方案，以尽可能降低不良反应风险，实现前房注射。由于啮齿类动物的眼部尺寸较小、房水体积有限以及晶状体位置特殊，眼内注射存在造成组织损伤的风险。操作过程中发生的组织损伤可能导致前房变浅、晶状体损伤以及前房细胞损伤和炎症等并发症。这些因素均会增加实验变异性并影响研究结果。切口的长度和角度至关重要。我们在前房最深的中央角膜区域做切口，角度接近水平。这样可形成一个较长的隧道，有助于减少房水流失。通过隧道注射可提高精确度，并降低触碰晶状体的可能性。所述的间充质注射方法可用于多种实验环境中，以构建疾病模型或评估不同治疗方法。我们预期，该注射技术的精确性和可重复性将在实验眼科学中成为一种有价值的工具。首先，为动物做好手术准备，并在其眼部滴加0.3%氧氟沙星和0.1%地塞米松。使用眼科手术镊，夹住角巩膜缘附近垂直中线处的上方巩膜以固定眼球。在手术显微镜下，将无菌的0.8毫米31号尖刃刀片置于垂直中线处的旁中央角膜区域。在此位置刺穿角膜以制作切口，并创建一条长隧道，直至进入前房中央区域。然后，向眼部滴加0.3%氧氟沙星和0.1%地塞米松滴眼液。接着，在裂隙显微镜下观察注射眼与未注射眼的前房深度差异。同时观察注射眼与未注射眼的晶状体情况。首先，将五微升（5 µL）的台盼蓝注入一支无菌的10微升玻璃Hamilton注射器中，该注射器配备一根34号钝针头。随后，将装有染料的注射器针头穿过自闭性角膜隧道进入前房。将溶液注入眼内，针头停留两到三秒，直至所有液体排尽。轻柔地拔出针头。在裂隙显微镜下进行检查。评估前房深度以排除变浅情况，并确认前房内存在台盼蓝。采用本方案，向Sprague Dawley大鼠的角膜注射了台盼蓝。注射后立即进行裂隙灯检查，结果显示前房明显被台盼蓝染色，证实该物质已成功递送至目标区域。首先，将5 µL Hoechst溶液吸入一支无菌的10 µL玻璃Hamilton注射器中，该注射器连接着34号钝针。通过自闭合的角膜隧道将针头插入前房并注入溶液。保持针头位置2至3秒，直至所有液体排尽。缓慢抽出针头以避免泄漏。随后摘除双眼眼球。为分离角膜，沿视神经周围的巩膜进行环形剪切，并从视神经向角膜方向再做四个切口。用沃特曼滤纸吸除多余液体。展开切开的巩膜，并将视网膜与巩膜分离。取出并弃去晶状体和视网膜。接下来，移除虹膜。剪除并弃去角膜周围的巩膜，小心地掀起角膜。将角膜置于玻璃载片上，用0.5%茜素红染色以识别内皮细胞。去除多余染料后，将角膜清洗三次，并在其上放置盖玻片。在光学显微镜下观察角膜，拍摄内皮细胞的茜素红染色图像。同时，在荧光显微镜下评估角膜，观察Hoechst染色情况，并与未注射的角膜（对照）进行比较。采用Hoechst染料（一种可穿透细胞膜的DNA结合型荧光标记物）通过前房注射评估药物的生物利用度。注射后15分钟，通过荧光显微镜观察角膜内皮细胞对Hoechst的摄取情况。茜素红染色用于显示内皮层的细胞间边界。此外，角膜内皮细胞核内出现阳性的Hoechst染色，证实了通过该方法成功递送了染料。

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Research

科研

JoVE Journal

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