Imagerie calcique des neurones corticaux utilisant Fura-2 heures
Summary
Signaux calciques jouent un rôle clé dans de nombreux processus cellulaires, y compris l'expression des gènes, la survie et la différenciation. Ici, nous montrent comment effectuer l'imagerie calcique utilisant Fura-2 heures. Imagerie calcique est un outil précieux pour étudier la régulation du calcium intracellulaire en temps réel et de sa réglementation des cascades de signalisation.
Abstract
Imagerie calcique est une technique courante qui est utile pour mesurer les signaux de calcium dans les cellules cultivées. Les techniques d'imagerie calcique profiter de colorants indicateurs de calcium, qui sont BAPTA basé molécules organiques qui changent leurs propriétés spectrales en réponse à la fixation d'ions Ca2 +. Colorants indicateurs de calcium entrent dans deux catégories, le ratio-métrique colorants comme la Fura-2 et indo-1 et une seule longueur d'onde, comme les teintures fluo-4. Ratio-métriques colorants changer soit leur excitation ou de leurs spectres d'émission en réponse au calcium, ce qui permet la concentration de calcium intracellulaire d'être déterminé à partir du ratio d'émission de fluorescence ou d'excitation à des longueurs d'onde distinctes. Le principal avantage de l'utilisation de ratio-métrique par rapport aux sondes colorants seule longueur d'onde, c'est que le rapport signal est indépendante de la concentration de colorant, de l'intensité d'éclairage, et la longueur du chemin optique permettant la concentration de calcium intracellulaire à être déterminée indépendamment de ces artefacts. Un des indicateurs de calcium la plus commune est Fura-2, qui a un pic d'émission à 505 nm et change son pic d'excitation de 340 nm à 380 nm en réponse à la fixation du calcium. Nous décrivons ici l'utilisation de la Fura-2 pour mesurer les élévations de calcium intracellulaire dans les neurones et autres cellules excitables.
Protocol
Discussion
Dans cette présentation, nous avons franchi toutes les étapes pour effectuer l'imagerie calcique utilisant Fura-2 heures. Nous avons utilisé les neurones corticaux comme un modèle, mais l'imagerie calcique peuvent être utilisés pour mesurer le calcium intracellulaire en temps réel dans une variété de cellules. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important d'utiliser des lamelles en verre au lieu du plastique, le plastique est souvent fluorescentes à des longueurs d'onde ultraviolettes, ce qui rend l'…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| New Item | Fura-2 AM | Invitrogen | F1221 | Protect from light |
| New Item | DMSO | EM Science | MX1457-6 | Keep in dry place to prevent hydration |
| New Item | Albumin from bovine serum | Sigma | A8022-100G | Store at 4° |
| New Item | Imaging Chamber | Warner Instruments | Model RC-20H | |
| New Item | Microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| New Item | Potassium chloride | SIGMA | P9333-500G | |
| New Item | Calibration Kit | Molecular Probes | F6774 | Protect from light |
References
- Grynkiewicz, . A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Lewis, . Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Dolmetsch, . Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes. J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).
