双光子轴突切除与活体斑马鱼胚胎的延时共聚焦成像

摘要

本文介绍了一种用于斑马鱼胚胎的固定方法，适用于长期成像、双光子成像和组织损伤技术，以及延时共聚焦成像。

摘要

长期以来，斑马鱼被用于通过活体透明胚胎的延时成像来研究发育过程中的细胞和分子机制。本文描述了一种用于长期成像的斑马鱼胚胎装片方法，并演示了如何利用共聚焦显微镜自动采集延时图像。我们还介绍了一种利用安装在双光子显微镜上的飞秒激光聚焦能量，在斑马鱼中对周围感觉轴突的单个分支造成可控且精确损伤的方法。成功的双光子轴突切断实验所需参数必须针对每台显微镜进行优化。我们将分别在一台自行搭建的双光子显微镜和一台蔡司510共聚焦/双光子显微镜上演示双光子轴突切断操作，以提供两个示例。

利用在感觉神经元特异性启动子驱动下表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因品系，可对斑马鱼三叉感觉神经元进行可视化观察¹。我们已对该斑马鱼三叉神经模型进行改进，以直接观察活体斑马鱼胚胎中感觉轴突的再生过程。实验中，将胚胎用三卡因麻醉后置于凝固的琼脂糖液滴中固定。固定后的胚胎被密封于充满苯硫脲（PTU）林格氏液的成像室中。我们发现，这些胚胎可在成像室内持续成像12至48小时。首先采集单张共聚焦图像，以确定轴切所需的靶位点。在双光子显微镜下以低功率（非损伤性）成像定位目标感觉轴突区域。在放大至预定轴切位点后，提高激光功率，对该特定区域进行单次扫描即可切断轴突。随后在共聚焦显微镜上设置多点时间序列成像，以直接观察轴突损伤后的恢复过程。

方案

第1部分：斑马鱼胚胎的长期成像固定

1. 准备1%低熔点琼脂糖溶液用于包埋。将琼脂糖溶于去离子水中，微波加热溶解后分装至小管中，并置于42摄氏度的加热块中保存。
2. 选择用于成像的胚胎，并用镊子轻轻撕开绒毛膜以去除。可在受精后22-24小时（hpf）将胚胎置于含5% PTU的林格氏液中，以抑制色素形成。这有助于提高成像清晰度，对于执行感觉轴突的双光子轴突切断实验至关重要。若允许自然色素形成，则在双光子显微镜下自体荧光会遮蔽轴突。斑马鱼用林格氏液含有116 mM NaCl、2.9 mM KCl、1.8 mM CaCl₂ 和 5 mM HEPES，pH 7.2。
3. 通过向PTU林格氏液中加入约0.02%三卡因对胚胎进行麻醉。在继续操作前，需确认动物对触碰无反应。
4. 通过在玻璃或聚四氟乙烯环的一侧涂抹真空脂，将其固定在盖玻片上，以制备长期成像用培养室。
5. 用玻璃移液管将一个胚胎转移至42摄氏度的琼脂糖溶液中，注意避免带入过多PTU林格氏液，然后将胚胎连同一滴琼脂糖转移至已准备好的盖玻片上。
6. 在琼脂糖凝固过程中将胚胎调整至所需位置。请注意，操作完成后需将成像室翻转，使盖玻片成为顶部表面。
7. 若使用电动载物台并需同时对多个位置成像，请对每个胚胎重复步骤1.4–1.6。
8. 待琼脂糖完全凝固后，向环内加入含0.02%三卡因的PTU林格氏液。
9. 在环的另一侧涂抹真空脂，然后用载玻片覆....

讨论

我们已采用所述方法精确切断外周感觉轴突，并直接观察活体斑马鱼胚胎中的轴突发芽再生过程。在斑马鱼中进行长期延时共聚焦成像可用于在体（in vivo）观察多种发育过程。文中描述的双光子轴突切断技术可根据多种不同的实验目标进行调整。我们曾采用相同的基本方法，通过将激光聚焦于细胞体而非外周轴突分支，实现了对整个三叉神经感觉神经元胞体的消融。任何可通过荧光识别的细胞类型，均可利用飞秒激光的聚焦能量实现精确损伤或消融。此前在其他多个生物系统中利用脉冲激光造成局部损伤或细胞消融的研究^4,5,6，启发了我们进一步完善斑马鱼体系中的这些技术。在对照实验中，我们证实轴突切断具有极高的精确性：即使相邻轴突属于同一细胞的分支，我们也从未对其造成损伤；仅偶尔损伤紧邻轴突的上皮细胞。这种特异性可归因于双光子激光激发的强度随离焦距离呈平方反比衰减^3,7。此外，由于激发态荧光分子释放的能量会参与光损伤过程，因此周围未标记的细胞更可能免受损伤。

损伤轴突所需的激光功率可能因激光设备的设置、组织深度以及实验目的的不同而有所变化。如果需要损伤胚胎中更深层的.......