S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

Summary

ここでは、出芽酵母でのタンパク質複合体を識別するための新しい定量的プロテオミクスの手法を説明します。本研究では、我々は、高い特異性でERタンパク質、Scs2pの結合パートナーを同定するためにタンデム質量分析が続くアフィニティー精製と一緒にSILACメソッドを使用している。

Abstract

脂質は細胞膜のビルディングブロックの障壁として及び細胞プロセスの区画で、そして最近では、重要な細胞内シグナル伝達分子として機能です。しかし、タンパク質とは異なり、脂質は主に膜の接触部位（MCSの）で起こると仮定しているが不十分で説明非小胞性の経路によって小さな疎水性分子は、トラフィックです。 MCSのは、小胞体（ER）は提携細胞小器官、例えば、細胞膜（PM）との直接的な物理的接触を行う領域です。 ER – PM MCSのER部分は、その脂質の合成は、これらのサイトにリダイレクトし、MCSのは脂質のトラフィックのために重要であることを意味しているを示唆し、脂質合成酵素に富んでいる。酵母は、1000種類以上の細胞あたりの連絡先、およびすべての真核生物におけるそれらの保存された自然と、ために彼らの豊かなER – PM MCSを研究する理想的なモデルです。 MCSを構成するタンパク質を明らかにする脂質のトラフィックは細胞内でどのように達成されるかを理解する上で重要な、そしてそれらがどのようにシグナル伝達分子として作用です。我々はScs2pと呼ばれるERは、ER – PMのMCSのに局在することを発見し、その形成に重要ですしている。我々はScs2pの分子のパートナーを発掘に重点を置いています。タンパク質複合体の同定は、伝統的に質量分析法によるタンパク質のバンドやペプチドの分析のゲル内消化に続いて、最初にゲル電気泳動によって精製したタンパク質サンプルを解決することに依存しています。これは、しばしばタンパク質の小さなサブセットに調査を制限します。また、タンパク質複合体は、手順の間に変性または非生理的な条件にさらされている。これらの問題を回避するために、我々は公平と定量データを抽出するために大規模な定量的プロテオミクスの手法を実装している。我々は、タグの付いていない対照菌株中のタンパク質にステープル同位体の原子核を組み込むために細胞培養におけるアミノ酸（SILAC）と安定同位体標識法を使用してください。タグ付けされた文化とタグなし、SILAC標識文化の等量を混合し、液体窒素中で粉砕することにより溶解されています。私たちは、その後、タンパク質複合体をプルダウンするアフィニティー精製の手順を実行します。最後に、我々は、高速液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法による分析のための準備ができているタンパク質試料を、沈殿させる。最も重要なことは、対照株のタンパク質は、重い同位体で標識し、餌の株では非標識蛋白質に対する定量することができる質量/電荷シフトを生成します。したがって、汚染物質、または非特異的な結合を容易に除去することができます。このアプローチを使用することによって、我々は、ER – PMのMCSのためにローカライズするいくつかの新規タンパク質を同定した。ここでは、我々のアプローチの詳細な説明を提示する。

Protocol

材料と方法酵母菌株本研究で使用したすべての菌株はBY4742背景に基づいています。 SILACのコントロール株（ マット、HIS3、LEU2、URA3、LYS2とarg4に：：G418は）：BY4742（マットアルファ、にarg4に欠失株（G418：マット、HIS3、URA3、LEU2、arg4は対象を ）交配することにより行われたHIS3、LEU2、URA3とLYS2）、および減数分裂半数体は四分子解剖によって得られた。?…

Discussion

精製処理中に保存さアリコートは、（1）事前に清澄化細胞ライセート、（2）結合画分、（3）非結合画分、および（4）溶出画分を含める必要があります。我々は、実験の結合と溶出効率を反映するために抗TAP抗体または銀染色を用いてウェスタンブロッティングにより上記アリコートの濃度のタンパク質を分析することをお勧めします。銀染色したゲルとブロットの例を図1に示されていま?…