Это видео должно популяризировать коллоидных Кумасси G-250 окрашивания протокол в соответствии с Кан<em> Соавт.</em> Для обнаружения среднем 4 нг белка в гелях. Окрашивание выполняется в течение 2 часов и без каких-либо усилий. Мы регулярно использовать протокол Канга для аналитических целей в основе геля протеомики.
Abstract
Кумасси бриллиантовый синий (CBB) является красителя обычно используется для визуализации белков, разделенных SDS-PAGE, предлагая простой процедуры окрашивания и высокий количественный. Кроме того, она полностью совместима с масс-спектрометрического идентификации белков. Но, несмотря на эти преимущества, CBB считается, менее чувствительны, чем серебро или флуоресценции окрашивания и поэтому редко используется для обнаружения белка в аналитической гель подходов протеомных.
Несколько улучшений оригинальной Кумасси протокол 1 были внесены повысить чувствительность CBB. Два основных изменения были внесены для повышения вероятности обнаружения низкого обильные белки путем преобразования молекул красителя в коллоидных частиц: В 1988 году Neuhoff и коллеги применяется 20% метанола и более высокие концентрации сульфата аммония в CBB G-250 решение на базе окрашивания 2, а в 2004 году Candiano и соавт. создана Blue Silver использованием CBB G-250 с фосфорной кислотой в присутствии сульфата аммония и метанола 3. Тем не менее, все эти изменения просто позволить обнаружения приблизительно 10 нг белка. Широко неизвестный протокол для коллоидного окрашивания Кумасси был опубликован Кан и соавт. В 2002 году, где они изменение коллоидного окрашивания CBB Neuhoff в протокол о комплексообразующих веществ. Вместо того, сульфат аммония они использовали сульфат алюминия и метанола была заменена менее токсичны этанола 4. Роман на основе алюминия, окрашивание в исследовании Кан показал высокую чувствительность, которая обнаруживает, даже в 1 нг / полоса (фосфорилазы б) с небольшим изменением чувствительности в зависимости от белков.
Здесь мы демонстрируем применение протокола Канга для быстрого и чувствительного коллоидного окрашивания Кумасси белков в аналитических целях. Мы проиллюстрируем быстрый и легкий протокол, используя двумерный гель регулярно проводится в нашей рабочей группы.
Protocol
Часть 1: двумерные (2-D) гель-электрофореза использованием чашки загрузкой IPG-полосы регидратации и изоэлектрической фокусировки (МЭФ) Увлажняет Immobiline DryStrip гели, рН 6-11 (7 см) в 125 мкл раствора регидратации [7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 4% CHAPS, 50 hydroxyethyldisulfide мм и 2% IPG буфера рН 6-11] с пом?…
Discussion
Инновационные или просто еще один протокол Кумасси?
На данный момент существует множество протоколов для окрашивания процедуры Кумасси бриллиантовый синий. Большинство из них возникают незначительные или значительные изменения одного из наиболее широко используемы?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Никола Wiethölter для подготовки и окрашивания 1-D гелей.
Эта работа финансировалась за счет гранта Deutsche Forschungsgemeinschaft (ГРК 1089/project 5 до Н. Д. и С. М.) и при поддержке исследований общении с Юргеном Manchot Stiftung в НД.
Materials
Name of product
Company
Catalogue No.
Comments
For IEF and SDS-PAGE:
Immobiline DryStrip gels
GE Healthcare
17-6001-94
Can even be used 2 years after expire date.
Immobiline DryStrip Reswelling Tray
GE Healthcare
80-6371-84
Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips.
Immobiline DryStrip Kit
GE Healthcare
18-1004-30
Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups.
EPS 3501 XL Power Supply
GE Healthcare
18-1130-05
Supplies voltage up to 3500 V.
Multiphor II Electrophoresis Unit
GE Healthcare
18-1018-06
Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips)
PerfectBlue gel system Twin S
Peqlab
45-1010-C
SDS-PAGE in 10×10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system.
For colloidal Coomassie G-250 staining:
staining dishes with lids
VWR
216-3412
Fits for mini-gels. Stackable on shaker.
aluminium sulfate-18-hydrate
Merck
1.01102.5000
We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package.
Dyballa, N., Metzger, S. Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels. J. Vis. Exp. (30), e1431, doi:10.3791/1431 (2009).