本视频方案展示了Johansen实验室用于制备Drosophila多线染色体以进行抗体标记的压片技术。
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摘要
摘要
果蝇长期以来一直是研究染色质结构与基因调控关系的首选模式系统，这得益于三龄幼虫唾液腺中巨大多线染色体所提供的细胞学优势。在此组织中，染色体经历多轮DNA复制而无细胞分裂，从而形成约1000个拷贝。每次复制后DNA仍保持平行排列，形成显著增大的染色体，为将染色质形态与特定蛋白质的定位相关联提供了独特机会。因此，人们高度关注在不同基因及转录过程不同阶段存在的表观遗传修饰。此类研究的重要工具之一，是利用针对特定酶、转录因子或组蛋白修饰的抗体对多线染色体进行标记。本视频方案展示了Johansen实验室用于制备果蝇多线染色体以进行抗体标记的压片技术。
方案
以下多线染色体压片制备方案改编自Johansen et al. (2009)中描述的实验步骤。
1. 三龄Drosophila幼虫的培养
为了获得高质量的唾液腺多线染色体压片，必须采用宽松的培养条件（例如，在标准的4英寸果蝇培养瓶中放入约20只产卵雌蝇，并每天更换至新瓶）。从第一批爬行的三龄幼虫中挑选最肥大的个体，选择时机应在其仍处于游走阶段但即将化蛹之前。我们通常在21°C下培养，但若在18°C下培养，可获得更粗大的染色体，这在某些情况下可能更为合适，例如需要高分辨率观察染色体带与间带区域时。
2. 多线体压片材料
- 德拉蒙德解剖镊（2 把）
- 培养皿（60 × 15 mm）
- 磨砂载玻片（Fisher No. 12-544-3）（多聚赖氨酸包被）
- 22 × 22 mm No. 15 盖玻片（Fisher No. 12-520B）（Sigmacote 包被；Sigma #SL2）
- 22 × 40 mm No. 15 盖玻片（Fisher No. 12-530B）
- 吸水纸（Kim-wipes）
- 配备 20X 物镜的相差显微镜
- 小型杜瓦瓶（例如真空瓶或保温瓶）
- 长镊子
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讨论
在传统的压片固定方案中加入乙酸和乳酸有助于提高染色体带间区的分辨能力以及染色体臂的伸展程度，但遗憾的是某些抗原表位在此处理过程中无法保留。H3S10ph 就是这类表位的一个例子（Cai et al., 2008）。由于酸处理还会淬灭GFP标签蛋白的内在荧光，DiMario et al.（2006）近期开发了一种基于甲醛的“无酸压片技术”，该技术无需使用GFP抗体标记即可直接观察融合GFP蛋白在多线染色体上的定位，同时还能用于检测对酸敏感的抗原表位。Johansen et al.（2009）对该方法的改进步骤进行了更详细的描述。图1展示了一个经酸固定处理的多线染色体压片样本，使用针对JIL-1组蛋白H3S10激酶的抗体与Hoechst进行双重标记的代表性结果。
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致谢
感谢 V. Lephart 女士对果蝇品系的维护。本工作得到美国国立卫生研究院基金（GM62916）和美国国家科学基金会基金（MCB0817107）的支持。
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参考文献
- Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila. Development. 135, 2917-2925 (2008).
- DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z.
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重印与许可
