使用Helios基因枪在洋葱细胞中进行蛋白质-蛋白质相互作用的双分子荧光互补（BiFC）检测

摘要

本文介绍了如何正确使用伯乐（BioRad）Helios基因枪将质粒DNA导入洋葱表皮细胞，以及如何基于双分子荧光互补（BiFC）原理在洋葱细胞中检测蛋白质-蛋白质相互作用。

摘要

研究基因在不同生物体中的功能依赖于了解基因产物在其正常细胞环境中如何相互作用。双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC）实验¹使研究人员能够可视化活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用，并已成为一项重要的研究工具。该实验基于荧光蛋白（GFP）的两个片段在潜在相互作用蛋白的介导下发生促进性结合的原理，其中每个GFP片段分别与一个潜在的相互作用蛋白融合。当两个目标蛋白发生相互作用时，将促进GFP的N端片段与C端片段的结合，从而恢复荧光信号。对于植物研究人员而言，洋葱表皮细胞是进行双分子荧光互补（BiFC）实验的理想体系，因其组织易于获取和制备，且荧光背景极低，可实现荧光信号的直接观察。Helios基因枪（BioRad）常用于将质粒DNA轰击导入洋葱细胞。本文演示了使用Helios基因枪导入两个相互作用蛋白对应的质粒构建体的方法Arabidopsis thaliana转录因子，SEUSS (SEU) 和 LEUNIG HOMOLOG (LUH)²以及通过BiFC在洋葱表皮细胞中可视化它们的相互作用。

方案

一、质粒制备

用于轰击的质粒DNA必须具有高纯度，浓度需达到500 ng/μl或更高。对于涉及两种质粒构建体的双分子荧光互补（BiFC）实验，每种质粒需要25 μg。换句话说，应将两种质粒按1:1的摩尔比混合，总共获得50 μg质粒DNA用于制备基因枪弹。需注意，加入的DNA总量超过50 μg可能导致金颗粒发生聚集，应避免这种情况。建议使用市售的质粒DNA提取试剂盒来分离质粒DNA。

质粒载体的大小应相对较小，例如 pUC19。我们将 SEU 和 LUH 的 cDNA 分别克隆到 pUC19-SPYNE 和 pUC19-SPYCE 中。³二元载体用于 农杆菌介导的转化因体积过大而不适用于轰击。

II. 色谱柱制备

质粒DNA包被金颗粒并将其装入塑料管中，随后将塑料管切割成约半英寸长的小段，即可装入基因枪的弹夹持器中，此过程称为弹夹制备。弹夹制备的详细步骤已在另一篇JoVE文章中有详尽描述⁴，因此本文不再赘述。在对洋葱细胞进行轰击时，我们建议每次制备使用50 μg质粒DNA与12.5 mg金颗粒混合，可制备约50个弹夹，每个弹夹含1 μg DNA和0.25 mg金颗粒。每个弹夹仅用于一次轰击。金颗粒的直径可选0.6 μm或1.0 μm（产品目录号分别为....

讨论

1. 对于初次使用者，我们建议使用单个组成型报告质粒（如 35S::GFP 或 35S::GUS）完整练习整个实验流程，从 cartridge 制备到观察。我们使用的 35S::GFP 质粒由 Steve Mount 和 Xiaoning Zhang 博士提供⁶（图 1A，D）。RioRad 出售的基因枪控制 cartridge（货号 165-2244）不适用于植物。
2. 进行 BiFC 实验时，需要设置第二个阳性对照，该对照应包含已知相互作用的两个蛋白，分别与 YFP 的 C 末端片段和 N 末端片段融合。
3. 进行 BiFC 实验时，必须包含多个阴性对照：（1）蛋白 X 与 YFP 的 N 末端片段融合，同时转入编码 YFP C 末端片段的空载体；（2）蛋白 Y 与 YFP 的 C 末端片段融合，同时转入编码 YFP N 末端片段的空载体；（3）仅转入空载体。
4. 在使用 Helios 基因枪射击时，可在枪管底部加装扩散屏，以减少组织损伤。在本研究中，我们未使用扩散屏。
5. 在显微镜下观察 BiFC 介导的 YFP 荧光时，应尽量缩短激发光照射时间，以减少光漂白。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
黄洋葱	任意供应商
Helios 基因枪	Bio-Rad
配备适用于 GFP 或 YFP 滤光片的荧光显微镜	Zeiss、Nikon、Olympus