Este protocolo de vídeo se muestra un método para la generación de transgénicos<em> Xenopus laevis</em> Por la introducción de transgenes en los núcleos de esperma seguido por transplante nuclear en óvulos no fertilizados.
La integración estable de productos de los genes clonados en el genoma de Xenopus es necesario para controlar el tiempo y el lugar de expresión, para expresar los genes en las etapas posteriores del desarrollo del embrión, y para definir cómo potenciadores y promotores de regular la expresión génica en el embrión. El protocolo ha demostrado aquí se puede utilizar para producir de manera eficiente transgénicos Xenopus laevis embriones. Este enfoque implica la transgénesis tres partes: 1. Los núcleos de los espermatozoides están aislados de adultos X. laevis testículos mediante el tratamiento con lisolecitina, que permeabilizes la membrana plasmática del espermatozoide. 2. Extracto de huevo se prepara por centrifugación a baja velocidad, además de calcio para hacer que el extracto de avanzar a la interfase del ciclo celular, y una centrifugación de alta velocidad para aislar el citosol de la interfase. 3. Transplante nuclear: los núcleos y el extracto se combinan con el ADN de plásmido linealizado para ser presentado como el transgén y una pequeña cantidad de enzima de restricción. Durante una reacción a corto, extracto de huevo parcialmente decondenses la cromatina de los espermatozoides y la enzima de restricción genera roturas cromosómicas que promueven la recombinación de los transgenes en el genoma. Los núcleos de los espermatozoides tratados son luego trasplantadas en los huevos no fertilizados. La integración del transgén ocurre generalmente antes de la primera división embrionaria de tal manera que los embriones resultantes no son quiméricos. Estos embriones pueden ser analizados sin necesidad de criar a la próxima generación, lo que permite la generación eficiente y rápida de los embriones transgénicos para el análisis del promotor y la función del gen. Adultos X. laevis como resultado de este procedimiento también se propagan los transgenes a través de la línea germinal y se puede utilizar para generar líneas de animales transgénicos con fines múltiples.
Para cada constructo transgénico a ensayar, por lo general, el trasplante en los núcleos 500-1000 huevos; a esta escala, podemos generar embriones transgénicos que expresan un máximo de 10 construcciones diferentes por día, dependiendo de cómo muchas mujeres se ven inducidos a poner sus huevos. De estos trasplantes, aproximadamente un tercio de los huevos y se unirá el 60-80% de estos embriones cortando proceder a través de la gastrulación normalmente. Dependiendo de las condiciones de reacción utilizadas, ent…
The authors have nothing to disclose.
La financiación de nuestro trabajo es proporcionado por el NIH, la March of Dimes y la Sociedad Americana del Cáncer.
A.Sperm nuclei preparation
Reagents:
Equipment:
B. Preparation of High Speed Extract
Reagents:
Equipment:
C. Nuclear transplantation.
Reagents:
Equipment:
Agarose dishes for injection: In a 60 mm plastic petri dish, lay a small 35mmX35mm weigh boat on molten 2.5% agarose in water 0.1XMMR to create a depression with an agarose-coated bottom for filling with eggs. Once agarose has hardened, wrap in parafilm and store at 4°C until use. Make 2-3 dishes in advance for each transgenic reaction you plan to do.
Infusion pump: We use a single syringe infusion pump from Harvard Apparatus, equipped with a 3 cc syringe/needle filled with mineral oil (Sigma M-8410). Blunt the syringe needle tip (to keep it from perforating the tubing) and attach the fine tygon tubing. Run the pump at ~10nl/sec; this assumes that the time the needle is in each egg will be no greater than 1 sec. Pump should be pre-run for several minutes prior to starting transgenesis for the day to assure that the plunger for the syringe is flush with the piston and that steady positive flow of oil out of the tubing is occurring.
Needles for nuclear transfers. Using a micropipette puller, generate needles with long, sloping tips. Clip these with a forcep under a dissecting microscope equipped with an ocular micrometer to obtain an ~80 micron opening with a beveled shape.
Other equipment: Xenopus laevis females, stereomicroscope, incubator, micromanipulator, microinjection needle puller (e.g. Model P-87, Sutter), syringe needles (26 gauge), glass microinjection needles, ocular micrometer for calibrated clipping of microinjection needle tips to 80μm diameter, petri dishes, weigh boats 35mm, Tygon tubing (ID=1/32 in., OD=3/32 in.)