单细胞解离 秀丽隐杆线虫一种分离活细胞的方法

摘要

来源：Germany, E. M.，等。从线虫Caenorhabditis elegans中分离特定神经元群体。J. Vis. Exp. （2019）。

本视频介绍了一种将整条蠕虫解离为适用于流式细胞术分选或完整细胞免疫沉淀的单细胞悬液的方法。

方案

本实验方案节选自 Germany et al 的研究《从线虫 Caenorhabditis elegans中分离特定神经元群体》，发表于J. Vis. Exp. (2019)。

1. 细胞分离用衰老线虫的制备与收集

注意：以下所述为从明尼苏达大学 Caenorhabditis 遗传学中心（CGC）菌株库获取的转基因 unc-17::GFP 菌株（OH13083）中分离胆碱能神经元的方法。必须保持无菌条件，以防止真菌或细菌污染。

1. 采用Stiernagle所述的漂白法准备并同步线虫。进行衰老实验时，将线虫转移至含有25 µM氟脱氧尿苷（FuDR）水溶液的线虫生长培养基（NGM）平板上，以减少产卵并抑制卵的孵化。定期检查琼脂平板，防止污染或卵孵化，以免导致结果不可靠。
   注意： 对于 unc-17::GFP 细胞，通常使用三块 100 mm × 15 mm NGM 平板来分离足量的目标细胞。
2. 收集线虫并制备细胞分离用缓冲液。
   1. 收集线虫至15 mL锥形管中。用1.5 mL M9缓冲液（1 mM MgSO₄）将线虫从培养皿中冲洗下来。₄，85 mM NaCl，42 mM Na₂HPO4·7H₂O，22 mM KH₂PO，pH 7.0）中，于1,600 × g离心5分钟 g弃去上清液，用1 mL M9缓冲液洗涤线虫。重复离心和洗涤，共进行五次，以尽可能去除 E. coli 尽可能减少污染。
      注意： 在此步骤中加入抗生素（如氨苄青霉素，50 µg/mL）有助于减少细菌污染。
   2. 对于两个样本，配制 2 mL 十二烷基硫酸钠-二硫苏糖醇（SDS-DTT）裂解缓冲液：200 mM DTT、0.25%（w/v）SDS、20 mM HEPES（pH 8.0）和 3%（w/v）蔗糖。
   3. 配制 15 mL 分离缓冲液（118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 10 mM HEPES, 10 mM 葡萄糖，pH 7.4）₂，2 mM MgCl₂，25 mM HEPES [pH 7.3]）并置于冰上保存。
      注意： SDS-DTT 裂解缓冲液和分离缓冲液均需在每次实验前新鲜配制。
3. 角质层破坏与单细胞分离
   1. 将步骤 1.2.1 中收集的动物样品在 1,600 x g 条件下离心 5 分钟 g去除所有上清液，将线虫重悬于1 mL M9培养基中，并转移至1.5 mL微量离心管中。
   2. 离心收集虫体，离心条件为 1,600 x g 5 分钟。
   3. 加入200 µL SDS-DTT裂解缓冲液至线虫中，在室温（RT）孵育5分钟。若在光学显微镜下观察，线虫体表应呈现“皱缩”状。
      注意： 长时间暴露于SDS-DTT裂解缓冲液可能导致线虫死亡，可通过观察线虫来监测。死亡的线虫会伸长且不会卷曲。
   4. 加入800 µL预冷的分离缓冲液，轻轻弹击离心管混匀。
   5. 以13,000 x g离心蠕虫1分钟 g 在 4 °C 下，去除上清液，并用 1 mL 裂解缓冲液洗涤。
   6. 重复步骤 1.3.5，共进行五次，每次均需小心移除分离缓冲液。
   7. 加入100 µL蛋白酶混合液 Streptomyces griseus (15 mg/mL) (材料表) 加入溶于分离缓冲液中的溶液至沉淀中，室温下孵育10−15分钟。
      注意： 与SDS-DTT裂解缓冲液类似，延长蛋白酶消化时间可能导致细胞质膜蛋白过度切割，从而阻碍通过磁珠分离表面暴露的GFP。
   8. 孵育蛋白酶混合液期间，使用200 µL移液枪头在1.5 mL微量离心管底部反复吹打样本约60−70次，以实现机械性解离。保持移液枪头紧贴微量离心管管壁并施加恒定压力，以充分解离细胞。
   9. 为确定消化程度，取少量消化混合液（约1−5 µL），滴于玻璃载片上，使用组织培养显微镜观察。孵育5−7分钟后，可见虫体碎片的角质层明显减少，并可清晰观察到细胞悬液。
   10. 使用900 μL市售的冷Leibovitz's L-15培养基终止反应，该培养基添加10%胎牛血清（FBS）以及青霉素-链霉素溶液（终浓度为50 U/mL青霉素和50 μg/mL链霉素）。
   11. 离心收集沉淀的片段和细胞，10,000 x g 离心5分钟 g 在 4 °C 下，用 1 mL 冷的 L-15 补充培养基洗涤沉淀细胞，重复两次，以确保去除多余的碎片和角质层。
   12. 将沉淀的细胞重悬于1 mL含L-15的培养基中，冰上静置30分钟。取上层约700−800 µL转移至微量离心管中。该层含有未受细胞碎片污染的细胞，用于后续目标细胞的分离。
   13. 根据制造商说明，使用自动细胞计数器或血细胞计数板测定 10−25 µL 分离细胞的细胞密度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂，分子生物学级	VWR	A0930
CaCl2	Sigma	C5670
Contess 自动细胞计数仪	Invitrogen	Z359629
DTT	USBiological	D8070
FBS	Omega Scientific	FB-02
氟脱氧尿苷	Sigma	F0503
HEPES	Sigma	H3375
KCl	Amresco	O395
KH2PO4	USBiological	P5110
Leibovitz L-15 培养基	Gibco	21083027
MgCl2	Sigma	M8266
MgSO4	USBiological	M2090
Na2HPO4·7H2O	USBiological	S5199
NaCl	VWR	X190
NaOCl（漂白剂）	Clorox
青霉素-链霉素	Fisher Scientific	15140122
Pronase E	Sigma	7433	灰色链霉菌蛋白酶混合物
SDS	Amresco	O227
SMT1-FLQC 荧光体视显微镜	Tritech Research
蔗糖	USBiological	S8010