激光捕获显微切割技术的果蝇外周神经元

Summary

在这个视频文章中，我们目前的方法隔离单个或多个果蝇 DA神经元使用红外线（IR）的捕获激光捕获显微切割（LCM）的类三龄幼虫。从孤立的神经元获得的RNA可以很容易地用于下游应用，包括QRT - PCR或芯片分析。

Abstract

树突状树枝状（DA）神经元的果蝇周围神经系统（PNS）在调查的基础类特定的树突形态^发生 1,2的分子机制提供一个极好的的模型系统。为了方便类特定的DA神经元发展的分子生物学分析，至关重要的是在一个纯粹的人口获得这些细胞。虽然一系列不同的细胞和组织特异性的RNA分离技术中存在的果蝇细胞，包括基于^磁珠细胞净化3,4，荧光激活细胞分选^{（FACS）5-8，}和RNA结合蛋白为^基础的战略9 ，概无这些方法可以很容易地利用空间精度与高度隔离的单个或多个类特定的果蝇DA能神经元。激光捕获显微切割（LCM）已成为一个非常强大的工具，可以用来从组织切片中分离出特定的细胞类型，具有高度的空间分辨率和精度。然后，可以从分离的细胞获得的RNA用于包括在一个给定的^细胞类型10-16的QRT - PCR和基因芯片表达谱分析。迄今为止，液晶显示模块没有被广泛应用在果蝇的组织和细胞^17,18，包括发展第三龄幼虫阶段的DA能神经元的分析。

在这里，我们目前对果蝇的大神经元使用的红外（IR）类LCM的隔离，我们优化的协议。这种方法允许单一，类特定或多个的DA能神经元具有高特异性和空间分辨率的捕捉。年龄相匹配的三龄幼虫表达的UAS - mCD8:绿色荧光蛋白 ¹⁹基因的控制下的IV级DA神经元具体PPK - GAL4 ²⁰驱动程序或泛DA神经元特异性21 - 7 - GAL4 ²¹驱动程序是用于这些实验。从孤立的DA能神经元获得的RNA是非常高的质量，并可以直接用于下游应用，包括QRT - PCR或芯片分析。此外，这种液晶显示模块协议，可以方便地用于捕捉到其他果蝇的细胞类型的不同阶段的发展依赖于具体，GAL4驱动 GFP的表达模式的细胞类型的。

Protocol

对果蝇 LCM的外周神经元的一般意见

允许来自6个小时，一个星期或液晶显示模块不再取决于组织类型和所需的细胞数量。

所有的程序都进行严格的无RNase条件以下的标准程序。幼虫表达无论是21 - 7 - GAL4，无人机mCD8::GFP或PPK - GAL4 UAS - mCD8::GFP转基因记者线，这些实验中使用。

1。准备幼虫

1. 收集30-40年龄相匹配的第三龄幼虫和DDH _{2 O}冲洗，随后进行了简短的在客场核糖核酸酶（Sigma - Aldrich公司）冲洗，最后洗删除核糖核酸酶在_DDH 2 。威克关闭多余的DDH _{2 O}完全用干净的Kimwipe事先嵌入在华侨城的幼虫。
2. 以干净的纸巾嵌入模具和一层薄（1.5毫米），华侨城层，就足以覆盖单层的幼虫。
3. 嵌入到幼虫之前，如果需要的话，冷却至0℃，在组织包埋模具的OCT。请放在模具上的冰块含有华侨城。这将有助于减少在嵌入过程中的幼虫的运动。
4. 将预冷OCT干净的幼虫，并安排他们在彼此平行。一旦幼虫已安排，慢慢填补，而不会干扰幼虫的安排与华侨城的模具。对齐冻结放在干冰块模具。 [ 关键的一步 :扣冻结的....

Discussion

本协议描述了我们对果蝇通过LCM的外周神经元的隔离的优化方法。虽然这LCM协议旨在为特定的隔离单，类特定或多个果 ​​蝇的大神经元从3龄幼虫阶段的发展，稍作修改的协议可以很容易地适用于其他果蝇的细胞类型的捕捉从所有发展使用不同的GAL4的阶段 ， 记者UAS - mCD8 - GFP转基因标签的细胞类型或类型的利益。我们的研究结果表明，激光捕获微解剖DA能神经元得到的RNA QRT - PCR或芯片为基础的分析的潜力，直接使用非常高的质量让。此协议的应用超出捕获的野生型细胞的兴趣，在这里讨论，LCM可结合使用功能丧失（UAS - RNAi）技术和/或获得性功能的研究从业人员的 GAL4 /无人机系统在利益的细胞类型。

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Materials