BrdU免疫荧光染色：一种用于鉴定细胞周期不同阶段细胞的技术

摘要

来源：Welschinger, R.，等。无需同步化的流式细胞术对细胞周期进程进行时间追踪。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频介绍了BrdU免疫荧光染色的实验方案。该技术可用于鉴定细胞周期不同阶段的细胞。通过添加DNA染料和抗体标记，可对S期细胞在后续时间点的命运进行详细分析。

方案

1. 溶液与试剂

1. 完全 RPMI 培养基
   1. 向 500 ml 的 RPMI-1640 培养基中加入 56 ml 胎牛血清（FCS）和 5.5 ml 200 mM L-谷氨酰胺。
2. DNase 溶液
   1. 用 DPBS 配制浓度为 1 mg/ml 的 DNase 溶液。
3. 染色缓冲液
   1. 用 DPBS 配制含 3% 热灭活 FCS 和 0.09% 叠氮化钠的溶液。
4. 固定缓冲液、通透缓冲液和洗涤缓冲液的定义请参见材料清单。

2. 细胞染色

注意：如果需要对细胞进行表面染色，请在固定前完成染色，并确保整个过程中细胞始终保存在 4 °C。

1. 将细胞重悬于 100 µl 染色缓冲液中（如需进行表面染色，加入针对表面抗原的推荐量抗体，并在 4 °C 下孵育 30 分钟）。
2. 加入 1 ml 染色缓冲液，以 150 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
   注意： 特异性抗体、浓度、孵育时间 等 将根据具体实验目的而有所不同。
3. ....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APC BrdU 流式检测试剂盒	BD Biosciences	552598	包含 BrdU 抗体、7-AAD 和 BD Cytofix/Cytoperm 缓冲液（以下简称固定缓冲液）
BD Perm/Wash 缓冲液	BD Biosciences	554723	以下简称洗涤缓冲液
BD Pharmingen 染色缓冲液	BD Biosciences	554656
Pipetman 移液器	Gilson	P2, P20, P100, P1000
DNase	Sigma	D-4513
BD Cytoperm 增强型通透缓冲液	BD Biosciences	561651	以下简称通透缓冲液
离心机	Spintron	GT-175R
AF488 标记抗组蛋白 H3 磷酸化（Ser10）抗体	Cell Signalling	9708S
磷酸化 Chk2（Thr68）(C13C1) 兔单克隆抗体	Cell Signalling	2197S
磷酸化 Chk1（Ser345）(133D3) 兔单克隆抗体	Cell Signalling	2348S
BD Falcon 12 × 75 mm FACS 管	BD Biosciences	352008