假性骨折是一种可重复的小鼠无菌性肌肉骨骼创伤模型，可用于评估创伤后晚期的免疫反应。本文逐步描述了该模型的操作流程，包括通过实验模型组合的可能性，以实现对多发性创伤的研究。
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本文内容
摘要
摘要
创伤后，机体早期会出现过度活跃的炎症反应，可能导致多器官功能障碍，并使创伤患者的死亡率升高；这种反应常伴随延迟性免疫抑制，增加感染相关的临床并发症，也可能进一步提高死亡率。1-9 目前已有许多研究开始评估创伤后免疫系统反应性的这些变化。10-15
免疫学研究得益于多种可用于体内建模的转基因和基因敲除小鼠，这些品系有助于深入探究参与免疫反应的分子通路。16-21
在实验性小鼠创伤建模中，长期研究存在较大挑战，因为小鼠骨折固定技术较为复杂且难以重复。22-30
这种假性骨折模型是一种易于复制的创伤模型，通过免疫学方式模拟肢体骨折环境，克服了上述困难，同时允许动物自由活动，并在无需持续、长期使用麻醉剂的情况下实现长期存活。该模型旨在重现长骨骨折的特征；在不破坏原有骨骼的前提下，使受损的肌肉和软组织暴露于受损的骨骼和骨髓环境中。
假性骨折模型包括两个部分：首先对后肢进行双侧肌肉挤压损伤，随后将骨溶液注射到这些受损的肌肉中。骨溶液的制备方法是从年龄和体重相匹配的同系供体后肢中取出长骨，将这些骨骼碾碎后重悬于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，从而制成骨溶液。
双侧股骨骨折是一种常用的、成熟的肢体创伤模型，在假骨折模型的开发过程中被用作对照模型。在多种可选的骨折模型中，我们选择采用伴有软组织损伤的闭合性骨折方法作为与假骨折相对照的模型，因为我们希望采用一种无菌但外周组织创伤程度相对严重的模型。31
在严重创伤情况下，失血性休克是一种常见表现，而全身性低灌注为创伤模型增加了非常重要的因素。32-36 假性骨折模型可轻松与失血性休克模型结合，构建出高严重程度的多重创伤模型。37
方案
1. 仪器和手术区域准备：
所有实验操作均需采用无菌技术进行。开始实验前，实验区域必须彻底清洁并灭菌。实验台面应先消毒，待其自然风干后，再用70%酒精擦拭。在实验工作区域内放置外科蓝色垫巾和无菌敷料巾。
所有材料和仪器在使用前均需高压灭菌。注射器和针头已预先灭菌，可直接使用。研究人员应正确穿戴实验服、外科口罩和无菌外科手套。
我们的手术器械每天晚上均通过高压灭菌器进行灭菌。手术后使用抗菌肥皂和水清洗器械，然后将其放置在洁净的手术蓝色垫上自然晾干。待干燥后，小心地将器械放入灭菌袋中，并进行灭菌以备后续使用。
打开热珠灭菌器，确保其温度升至适宜范围——300–350°F，然后方可开始实验。该灭菌器将在对各小鼠进行实验操作期间用于器械的清洁。取一个不锈钢器械托盘，加入70%乙醇至其容积的1/3处，乙醇量应足以浸没所有手术器械。打开循环加热垫，在其上放置外科蓝色垫巾，再在其上方覆盖无菌手术敷料。该加热装置用于在实验操作及恢复期间维持小鼠的适宜体温。将所有无菌器械、纱布、注射器、针头以及一个1.5 mL离心管放置于无菌敷料上。开启无菌器械及其他物品时需格外小心，避免用手接触造成污染。建议在进行此准备操作时佩戴无菌手套。
2. 假性骨折模型 - 实验步骤：
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讨论
假性骨折是一种可重复的小鼠无菌性肌肉骨骼创伤模型，可用于评估创伤后的免疫反应。该假性骨折模型通过模拟长骨骨折的特征，在免疫学上重现了肢体骨折的环境：受损的肌肉和软组织暴露于损伤的骨组织和骨髓，但不破坏原有的骨骼结构38,39。在假性骨折创伤后可观察到一种双相免疫反应，其特征是早期出现高炎症反应，并在6小时达到峰值；随后进入第二阶段，表现为延迟性免疫抑制，在约48小时处呈现低谷。该模型有助于克服某些实验性小鼠创伤建模中的挑战，例如复杂的骨折固定操作，且难以重复。特别是，该模型允许动物在不发生原生骨骨折的情况下长期存活，因而适用于对创伤后免疫反应进行晚期阶段的研究。
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披露
动物实验严格遵循匹兹堡大学机构动物照护与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee）以及研究行为与合规办公室（Research Conduct and Compliance Office）所制定的指南与规定进行。该机构为经美国实验动物科学协会（AALAS）和美国实验动物管理评估认证协会（AAALAC）认证的单位。实验动物来源包括杰克逊实验室（Jackson Laboratories）和查尔斯河实验室（Charles Rivers Laboratories）。所有动物在供应商层面以及匹兹堡大学内部的动物健康监测项目中均接受了全面的健康保障检测。本研究遵循美国政府关于脊椎动物使用的基本原则。该项目已在美利坚合众国农业部（USDA）注册，并获得了公共卫生服务部实验室动物福利办公室（Public Health Service Office of Laboratory Animal Welfare）的保证书函。
致谢
资助来源 / 编号 分子生物学与出血性休克 GM053789
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 手术用蓝色垫单 | Fisher Scientific | 50-7105 | |
| 无菌敷料 | Fisher Scientific | NC9517505 | |
| 循环加热垫 18"x26" | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| 热珠灭菌器 | VWR 国际公司 | 11156-002 | |
| 不锈钢托盘 8" ×11" | VWR 国际公司 | 62687-049 | |
| 有机玻璃板（10×15×0.5 cm） | 匹兹堡大学机械加工车间 | ||
| 胶带卷 1" | 企业快递 | MMM26001 | |
| 50毫升锥形管 | 任何供应商 | ||
| 直边广口瓶（用作鼻锥的盖子） | VWR 国际公司 | 159000-058 | |
| Oster A5 电动剪毛器，配40号刀头 | VWR 国际公司 | 10749-020 | |
| 手术剪（直型） – 12 cm | Fine Science Tools | 14068-12 | |
| 止血钳，弯型，18 cm | Harvard Apparatus | 81331718 | |
| 镊子（0.8 mm 尖端，弯曲型，10 cm） | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| 纱布 4"x4" | 任何供应商 | ||
| 1.5 cc 微型离心管 | 任何供应商 | ||
| 冰桶 | 任何供应商 | ||
| 研钵和研杵 | Fisher Scientific | 12-961AA | |
| 1毫升注射器配25G针头 | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| 20G针头 | 任何供应商 | ||
| 1 mL 移液器 | 任何供应商 | ||
| 1 mL 移液器吸头 | 任何供应商 | ||
| Falcon 聚苯乙烯 8 ml 管 | VWR 国际 | 60819-331 | |
| 灭菌袋 3"x8" | VWR 国际公司 | 24008 | |
| 灭菌袋 5"x10" | VWR 国际公司 | 24010 | |
| MacConkey II 琼脂平板 | BD 生物科学 | 221172 | |
| 乙醇 - 200 proof | Pharmco-AAPER | [70%] | |
| 戊巴比妥钠（Nembutol 钠溶液） | OVATION Pharmaceuticals | 70 mg/kg | |
| 异氟烷（Isoflurane） | Baxter Internationl Inc. | 99.9% | |
| 聚维酮碘（贝塔碘） | 三件式一次性用品 | ||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | |||
| 盐酸丁丙诺啡 | 贝德福德实验室 | 0.1 mg/kg |
参考文献
- DeCamp, M. M., Demling, R. H. Posttraumatic multisystem organ failure. JAMA. 260, 530-534 (1988).
- Deitch, E. A. Multiple organ failure. Pathophysiology and potential future therapy. Ann Surg. 216, 117-134 (1992).
- Carrico, C. J., Meakins, J. L., Marshall, J. C.
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