Drosophila melanogaster 幼虫为研究幼虫体节神经中轴突运输的机制提供了一个理想的模型系统。通过该实验流程，可将携带各种突变的3rd 龄幼虫与野生型幼虫进行比较。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
Drosophila melanogaster 正成为研究神经系统发育与功能的有力模型系统，尤其得益于其便利的遗传操作性和已完成全基因组测序的优势。此外，幼虫神经系统是研究轴突运输机制的理想模型系统，因为幼虫的体节神经包含成束的轴突，其胞体位于脑内，而神经末梢则沿身体长度分布。本文描述了在幼虫体节神经中可视化突触囊泡蛋白的操作流程。若操作得当，神经系统的所有组分以及相关组织（如肌肉和神经肌肉接头）均能保持完整、无损伤，并可用于后续观察。携带不同突变的3rd 龄幼虫经解剖、固定、与突触囊泡抗体孵育后，与野生型幼虫一同进行观察和比较。该流程可适用于多种不同的突触或神经元抗体，便于在幼虫体节神经中直观观察多种蛋白分布的变化。
方案
1. 试剂的准备
- 使用 128 mM NaCl、4 mM CaCl2、4 mM MgCl2、2 mM KCl、5 mM HEPES 和 36 mM 蔗糖配制 1× 解剖缓冲液。将溶液 pH 调至 7.2，并过滤除菌。
- 用 16% 甲醛与 1× 解剖缓冲液按 1:1 比例稀释配制固定液。
- 将 1× 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）与 Triton X-100 按 1:100 比例混合，配制 1× PBT。
- 在 1× PBS 中配制含 0.01% 叠氮化钠的 5% 牛血清白蛋白（BSA）溶液。
2. 解剖前的准备
- 使用Sylgard培养皿进行解剖。通过将Sylgard 184硅弹性体基质与固化剂混合物倒入培养皿中来制备培养皿。待混合物完全固化并干燥后方可使用。
- 解剖前，准备一把洁净的#5镊子、一把洁净的直刃Vannas剪刀以及固定用针。
3. 3的解剖rd 龄期幼虫
- 收集游走的3rd 将特定基因型的龄期幼虫置于培养皿中。
- 用去离子水清洗幼虫以去除食物残渣。
- 将幼虫置于Sylgard培养皿中，腹....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
该 果蝇 幼虫节段神经是研究轴突运输机制的有力系统。如果3rd 若正确进行幼虫龄期解剖，可在单个幼虫中观察中枢神经系统（CNS）、外周神经系统（PNS）以及相关组织（如肌肉和神经肌肉接头）。本实验方案改编自Hurd和Saxton（1996）发表的方法。该方案亦可适用于其他神经元抗体的检测，但需对抗体条件进行优化。一抗和二抗的孵育时间可作调整，也可增加封闭步骤。我们已成功应用此方案研究淀粉样前体蛋白的功能 1 和亨廷顿蛋白 2 在轴突运输中。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
SG 获得了纽约州立大学布法罗分校和约翰·R·奥伊谢基金会的资金支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 镊子 | 精细科学工具公司 | 11252-20 | |
| 微型不锈钢固定针 | 精细科学工具公司 | 26002-10 | |
| Mcpherson-Vannas 直刃剪刀，8 cm | 费舍尔科技公司 | 50822236 | |
| Vectashield 封片介质 | Vector Laboratories 公司 | H-1000 | |
| Sylgard 184 硅橡胶弹性体 | 道康宁公司 | 4026148 | |
| 甲醛，16% | 电子显微镜科学公司 | 15710 | |
| dCSP3 | 发育研究杂交瘤库 | ||
| Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgG | 英杰公司 | A-11004 |
参考文献
- Gunawardena, S., Goldstein, L. Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila. Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
