本文介绍了一种从雌性黑寡妇蜘蛛腹部高效去除丝腺的策略。该方法能够快速分离出七种不同类型的丝腺，且纯度较高，对于研究蜘蛛丝生成和纤维组装的科研人员而言，这一过程至关重要。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
现代蜘蛛能够纺出具有多种生物学功能的高性能丝纤维，包括运动、捕食以及保护发育中的后代1,2。蜘蛛通过纺制多种不同类型的纤维来完成这些任务，这些纤维具有各异的力学性能。纤维类型的这种特化是通过进化出不同的丝腺实现的，这些丝腺作为小型生物工厂发挥作用。这些生物工厂负责制造并储存大量丝蛋白，以用于纤维的生产。通过一系列复杂的生化过程，这些丝蛋白在挤出时从液态转化为固态物质。
力学研究表明，蜘蛛丝的强度超过高抗拉强度钢3。对蜘蛛丝纤维结构与功能关系的分析表明，蜘蛛丝主要由蛋白质（即丝心蛋白）构成，这些蛋白质在其氨基酸序列中具有重复的模块结构4。通过对丝腺cDNA的翻译产物进行分析，研究人员正在逐步揭示赋予蜘蛛丝惊人抗张强度和延展性的共同分子特征。鉴于蜘蛛丝卓越的材料特性，全球各地的研究实验室正竞相深入了解并模拟其纺丝过程，以制备可用于商业、军事和工业领域的合成蜘蛛丝纤维。在实验室中人工纺制蜘蛛丝面临的主要挑战之一，是对纤维从丝腺挤出过程中所发生的生化过程进行全面理解。
本文介绍了一种从结网型黑寡妇蜘蛛中分离七种不同丝腺的方法，包括大壶状腺和小壶状腺[分别产生牵引丝和支架丝]5,6、管状腺[合成卵囊丝]7,8、鞭状腺[在结网蜘蛛中的功能尚不明确]、凝集腺[产生黏性丝]、梨状腺[产生附着盘丝]10以及aciniform腺[合成包裹猎物和卵囊的丝线]9。该方法基于使用二氧化碳气体对蜘蛛进行麻醉，随后将头胸部与腹部分离，并对腹部进行显微解剖以获取丝腺组织。在分离出不同类型的丝腺后，这些组织可用于提取多种大分子，以进行不同的生化分析，包括实时定量PCR、Northern印迹和Western印迹、质谱（MS或MS/MS）分析，以鉴定新的丝蛋白序列，筛选参与丝蛋白组装通路的蛋白质，或利用完整组织进行细胞培养或组织学实验。
方案
1. 麻醉蜘蛛并分离腹部
- 将蜘蛛从玻璃罐转移到内衬塑料膜的纸盒中（图1A）。我们通常从木堆、车库或灌木丛中采集蜘蛛，并在实验室的玻璃罐中饲养。由于蜘蛛无法攀爬塑料内衬，因此这是一种有效的转移方法，可将蜘蛛从玻璃罐或咖啡罐转移到较小的样品瓶中，以便进行麻醉。在此过程中操作蜘蛛时，出于安全考虑，应佩戴两层乳胶手套或园艺手套。
- 当蜘蛛位于内衬塑料膜的纸盒中时，从其后方接近，让蜘蛛滑入塑料培养管中。蜘蛛进入管内后，立即盖上塞子（图1B）。建议使用尺寸约为101.6 mm × 31.75 mm（长×直径）的样品管。这样可最大限度减少麻醉步骤所需的二氧化碳气体用量。
- 以5–10 psi的压力通入二氧化碳气体，持续10分钟，使蜘蛛麻醉（图1C）。此剂量的气体仅能使蜘蛛失去活动能力约5分钟，因此麻醉后必须立即进行步骤1.4–1.5。
- 将麻醉后的蜘蛛放入小型解剖皿中，用镊子将其调整为背面向上（红色沙漏斑纹朝下）。
- 剪断连接头胸部与腹部的细柄状结构（即柄部），使腹部与蜘蛛其他部分分离（图1D）。将头胸部放入培养皿中，置于冰箱冷冻过夜，次日冻实后丢弃。移动头胸部时需小心，因为蜘蛛的毒牙位于该部位。
- 用一根昆虫针将腹部固定在小型解剖皿内的Sylgard材料上。将昆虫针穿过剪断柄部后留下的孔洞（图1E），该位置通常可见液体渗出，易于识别。确保纺器（与柄部相对的一端）朝向解剖皿底部（即靠近操作者的一侧）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
我们提供的黑寡妇蜘蛛丝腺显微解剖方法，是一种获取高纯度丝腺组织的有效手段。解剖过程可在1.5至3小时内完成，能够从结网型蜘蛛中分离出全部七种不同类型的丝腺。获得高纯度的丝腺样本使研究人员能够开展多种生物化学研究，包括利用质谱技术鉴定腺腔内容物中储存的新丝蛋白或分子伴侣蛋白、分析在不同类型腺体中选择性表达基因的mRNA水平，以及特定腺体的体外培养。 体外 研究蚕丝生产的机制。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由美国国家科学基金会RUI基金（项目编号：MCB-0950372）资助，项目名称为“黑寡妇蜘蛛丝的分子表征”。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化钠 | Electron Microscopy Sciences | SX0420-1 | 水中 0.1 M |
| 焦碳酸二乙酯 | Sigma-Aldrich | D-5758 - 5 ml | 0.1% v/v |
| 柠檬酸钠 | Sigma-Aldrich | S1804 - 1 kg | 水中 0.015 M |
| 解剖显微镜 | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| 数码显微镜相机 | Leica Microsystems | DFC320 | 软件 - Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas 剪刀 | World Precision Instruments, Inc. | 500260 | |
| 不锈钢镊子 | World Precision Instruments, Inc. | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| 昆虫针 | Indigo Instruments | 33414-2 | 昆虫针 #2 |
| 小型或大型解剖皿 | Living Systems Instrumentation | DD-50-S 或 DD-90-S | 52 mm 直径 × 18 mm 高（Sylgard 深度约 6 mm）或 93 mm × 22 mm |
| Drosophila 培养管 | Carolina Biological | FR-17-3076 | 尺寸为 31.75 mm 直径 × 101.6 mm |
参考文献
- Vollrath, F., Knight, D. P. Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).
- Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. Endeavour. 10, 31-31 (1986).
- Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).
- Lewis, R. V., Xu, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).
- Colgin, M. A., Lewis, R. V. Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).
- Tian, M., Lewis, R. V. Appl. Phys....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
