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显微切割的黑寡妇蜘蛛丝绸生产腺体

DOI:

10.3791/2382

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January 11th, 2011

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1Department of Biological Sciences, University of the Pacific

In This Article

Summary

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在这里，我们描述了一个有效的策略，以消除雌性黑寡妇蜘蛛腹部的丝生产腺体。此过程允许的七个不同的丝绸生产腺体高度纯化的时尚，一个调查研究蜘蛛丝的生产和纤维大会的重要的过程中迅速隔离。

Abstract

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现代蜘蛛自旋高性能纤维丝，具有广泛的生物学功能，包括运动，捕获猎物和保护发展的后代 1,2 。蜘蛛来完成这些任务的纺纱几个不同的光纤类型有不同的力学性能。这种专业化的光纤类型有发生，通过不同的丝腺，小biofactories功能的演变。这些biofactories制造和储存大量的丝蛋白纤维生产。通过一系列复杂的生化事件，这些丝蛋白是从液态转换成固体物质一经挤出。

机械的研究表明，蜘蛛丝都强于高强度钢3。了解蜘蛛丝线的结构和功能之间的关系的分析发现，蜘蛛丝主要包括蛋白质，或fibroins，在其蛋白质序列4块重复。通过翻译的丝绸的cDNA分析，作出贡献，以令人难以置信的蜘蛛丝的拉伸强度和可扩展性的分子共同签名正在揭开。由于蜘蛛丝的非凡的材料特性，世界各地的研究实验室都在竞相理解和模仿的纺纱工艺，生产人造丝纤维，商业，军事和工业应用。纺纱的研究实验室中的人造蜘蛛丝的主要挑战之一，涉及了从丝绸生产腺体的纤维的挤压过程中发生的生化过程的完整的理解。

在这里，我们提出了七个不同的丝绸生产cobweaving黑寡妇蜘蛛，其中包括主要和次要的ampullate腺体腺体[生产吊斗铲和脚手架丝绸] 5,6，tubuliform [综合蛋的情况下丝] 7隔离的方法，8，flagelliform [COB -织布未知功能]，总[胶丝，aciniform [综合猎物包装和蛋的情况下线程] 9号和梨状[生产附件光盘丝绸] 10。这种方法是根据麻醉蜘蛛与二氧化碳气体，随后的分离从腹部的头胸部和腹部的显微切割获得的丝绸生产的腺体。随着丝绸生产的不同腺体分离，这些组织可用于检索不同的大分子，包括实时定量PCR，北部，免疫印迹，质谱（MS或MS / MS）分析，确定不同的生化分析新的蚕丝蛋白序列，蛋白质参与丝绸大会通路，或使用完整的组织细胞培养或组织学实验搜索。

Protocol

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1。麻醉蜘蛛腹部和隔离

  1. 蜘蛛从一个玻璃瓶转移到一个纸箱内衬塑料（图1A）。我们通常从woodpiles，车库或灌木丛中收集的蜘蛛和玻璃罐的实验室，他们的房子。由于蜘蛛不能爬上塑料衬里，它提供了一个有效的方法来从一个玻璃瓶或咖啡可以转移到一个较小的小瓶anesthetizing目的的蜘蛛。虽然处理的蜘蛛，在这一点上，你应该穿两双乳胶手套或为安全起见，园艺手套。
  2. 虽然蜘蛛衬塑框，方法从背面的蜘蛛，让蜘蛛幻灯片的塑料培养瓶。蜘蛛后进入小瓶，立即将插头在上面（图1B）。我们建议使用一小瓶，大约为101.6毫米x 31.75毫米（长x宽）。这最大限度地减少二氧化碳气体的anesthetizing步骤所需的金额。
  3. 麻醉的蜘蛛，在每平方英寸5-10磅二氧化碳气体为10分钟（图1C）。这种气体的数量只会敲蜘蛛5分钟左右，因此麻醉后，你必须立即进行步骤1.4-1.5。
  4. 放置到一个小夹层菜的麻醉蜘蛛和使用产钳的位置蜘蛛背的一面向上（红色沙漏朝下）。
  5. 夹蒂（窄柄连接头胸部和腹部）释放其余的蜘蛛（图1D）的腹部。在培养皿过夜存放在冷冻的头胸部和丢弃后冻结的第二天。要小心蜘蛛的毒牙是目前这一细分市场上移动时头胸部。
  6. 拧紧腹部小夹层菜Sylgard材料，使用单一的昆虫针。通过从花梗裁剪（图1E）的孔插入昆虫针。这可以很容易地被认定为流体的地点是从剪裁的花梗新兴。确保的喷丝板（花梗的另一端）正朝着面向底部离您最近的。

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Discussion

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我们从黑寡妇蜘蛛丝生产腺体的显微解剖的方法提供了一种有效的手段，获得高度纯化的的丝绸生产的腺体。解剖在1.5至3小时就可以完成，产生了七个不同的一套完整的丝绸生产从cobweavers腺体。获得高度纯化的样品丝腺，让调查人员能够执行广泛的生化研究，包括确定新的丝绸或使用质谱分析mRNA水平的选择性表达的基因在不同的腺体内腺体管腔内容存储伴侣蛋白，并在体外培养特定腺体的研究丝绸生产的机制。

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
没有利益冲突的声明。

Acknowledgements

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这项工作是由一个NSF的锐格兰特MCB - 0950372题为黑寡妇蜘蛛丝的分子表征支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
氯化钠电子显微镜科学SX0420-10.1 M 水溶液
焦碳酸二乙Sigma-AldrichD-5758 - 5 ml0.1% v/v
柠檬酸钠Sigma-AldrichS1804 - 1 kg0.015 M 水
解剖显微镜徕卡显微系统 徕卡 MZ16
数码显微镜相机徕卡MicrosystemsDFC320软件 - Leica Application Suite v2.8.1
Vannas 剪刀World Precision Instruments， Inc.500260
不锈钢镊子World Precision Instruments， Inc.501764迷你 Dumont #M5S
昆虫针Indigo Instruments33414-2昆虫针 #2
小型或大型解剖皿生活系统仪器DD-50-S 或 DD-90-S直径 52 毫米直径 x 18 毫米高（Sylgard 深度 ~6 毫米）或 93 毫米 x 22 毫米
果蝇 培养瓶Carolina BiologicalFR-17-3076尺寸为 31.75 毫米直径 x 101.6 毫米
酯

References

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  1. Vollrath, F., Knight, D. P. Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).
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  6. Colgin, M. A., Lewis, R. V. Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).
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