Este protocolo descreve um procedimento para estudar a respiração das mitocôndrias isoladas dos músculos esqueléticos. Este método foi adaptado de Scorrano<em> Et al.</em> (2007). O procedimento de isolamento mitocondrial requer cerca de 2 horas. A respiração mitocondrial pode ser concluído em cerca de 1 hora.
As mitocôndrias são organelas controlar a vida ea morte da célula. Eles participam nos principais reações metabólicas, sintetizar a maior parte do ATP, e regular uma série de cascatas de sinalização 2,3. Pesquisadores passadas e actuais, mitocôndrias isoladas de ratos e camundongos tecidos como fígado, cérebro e coração 4,5. Nos últimos anos, muitos pesquisadores se concentraram em estudar a função mitocondrial dos músculos esqueléticos.
Aqui, descrevemos um método que temos utilizado com sucesso para o isolamento de mitocôndrias de músculo esquelético 6. Nosso procedimento requer que todos os tampões e reagentes são feitas fresco e precisa de cerca de 250-500 mg de músculo esquelético. Foram estudadas mitocôndrias isoladas de ratos e camundongos gastrocnêmio e diafragma e os músculos extra-oculares de ratos. Concentração de proteína mitocondrial é medido com o ensaio de Bradford. É importante que as amostras mitocondrial ser mantida gelada durante a preparação e que estudos funcionais ser realizada dentro de um prazo relativamente curto (~ 1 hr). Respiração mitocondrial é medida usando polarografia com um eletrodo do tipo Clark (sistema Oxygraph) a 37 ° C 7. Calibração do eletrodo de oxigênio é um passo fundamental neste protocolo e deve ser realizada diariamente. Mitocôndrias isoladas (150 mg) são adicionados a 0,5 ml de tampão experimental (EB). Estado respiração 2 começa com adição de glutamato (5mM) e malato (2,5 mM). Então, difosfato de adenosina (ADP) (150 mM) é adicionado para começar estado 3. Oligomicina (1 mM), um bloqueador sintase ATPase, é usado para estimar o estado 4. Por último, carbonil cianeto de p-[trifluoromethoxy]-fenil-hidrazona (FCCP, 0,2 mM) é adicionado à measurestate 5, ou não atrelados a respiração 6. A relação de controle respiratório (RCR), a relação entre o estado 3 para o estado 4, é calculado depois de cada experimento. Um RCR ≥ 4 é considerado como evidência de uma preparação de mitocôndrias viáveis.
Em resumo, apresentamos um método para o isolamento de mitocôndrias viáveis a partir de músculos esqueléticos que podem ser usadas em bioquímica (por exemplo, atividade enzimática, imunodetecção, proteômica) estudos e funcionais (respiração mitocondrial).
Nós apresentamos um protocolo para isolar mitocôndrias viáveis do músculo esquelético. Se o rendimento é um problema, o protocolo pode ser modificada, incubando o músculo isolado em 5 ml de tripsina EDTA/0.01 PBS/10mM% por 30 minutos em gelo. Para assegurar a digestão muscular completo com tripsina, o músculo precisa ser totalmente picada. Após a incubação de 30 minutos, a solução de tripsina PBS/10mM EDTA/0.01% deve ser completamente substituído com 3 ml de isolamento tampão 1 (IB1). Além disso, …
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por uma concessão do National Eye Institute (R01 EY12998) para FH Andrade.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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95% CO2 / 5% O2 mix | Local gas company | |||
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma | A2754 | ||
Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | ||
Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | ||
Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
Centrifuge 5804R | Eppendorf | |||
Compressed nitrogen | Local gas company | |||
D-mannitol | Sigma | M9647 | ||
Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | ||
Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma | A8806 | ||
Glutamic acid | Sigma | G5889 | ||
HEPES sodium salt | Sigma | H7006 | ||
Isotemp 3006D | Fisher Scientific | |||
Magnesium chloride | Sigma | M8266 | ||
Male Sprague Dawley Rats | Harlan | 300-500g | ||
Malic acid | Sigma | M9138 | ||
Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | ||
Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
Oxygen electrode disc | Hansatech | S1 | ||
Oxygraph | Hansatech | |||
Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | |||
pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | ||
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | ||
Potassium chloride | Sigma | P3911 | ||
Potassium phosphate | Sigma | P8416 | ||
Potter-Elvehjem homogenizers | Fisher | 08-414-14A | ||
PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane | Hansatech | S4 | ||
SKIL 3320 drill press | Hardware store | |||
Sucrose | Sigma | S5016 |