Summary
此协议，介绍了一种酶水解，利用酶标仪来衡量和分类，土壤磷P单酯，磷酯和无机体育多达96个样品，可以在一次在一个标准的实验室测量高通量的方法。
Abstract
许多类型的有机磷（P）的分子存在于环境样品1。传统的P的测量并没有发现这些有机磷化合物，因为它们不与 2,3比色试剂反应。酶法水解（EH）是一个新兴的方法，准确定性 4,5环境样品中的有机磷形式。这种方法只莫须有的准确性，磷- 31核磁共振光谱仪（31个P - NMR）的方法，价格昂贵，需要专门的技术training6 。我们已经适应了酶解方法，能够测量三磷类（酯磷和无机磷酯磷，），酶标仪系统 7 。这种方法提供了一种快速，准确，价格合理，用户友好的方式来衡量，在土壤，沉积物，粪肥和，如果集中，水产品样品的P物种的研究人员。这是唯一的高通量方法的测量可以在一个标准的实验室进行的形式和有机磷酶不稳。由此产生的数据提供了洞察科学家研究系统养分含量及富营养化的可能性。
Protocol
1。磷类萃取
- 准备一个0.25米的氢氧化钠（NaOH，40.00克/摩尔）+ 0.05 mol乙二胺四乙酸（EDTA，292.24克/摩尔）1L解决方案。
- 添加30毫升的NaOH + EDTA溶液2克湿或干的土壤样品50 mL锥形管/。
- 孵育16在室温下搅拌。
- 离心机3000 XG 3分钟。
2。样品提取液的pH值调整
- 传输0.1毫升分装到1.5 mL微量离心管。
- 添加0.017毫升冰醋酸2.5米，0.144 mL的0.4 M醋酸缓冲液醋酸钠（70.5％[CH 3 COONa，82.03克/摩尔]和29.5％的乙酸，pH值5.0），和0.739 mL去离子水。
- 调整后的提取物的最终体积将1 mL和最终pH为5.0。
3。酶联合溶液的制备
- 准备1 L 0.1 M的醋酸钠（CH 3 COONa，82.03克/摩尔）解决方案，pH值5.0 。
- 准备在醋酸钠缓冲等，最终浓度是每0.5个单位/毫升的步骤3.1准备2 × 10 mL的酸性磷酸酶的储备液。
酸性磷酸酶型我从小麦 （小麦胚芽，GP，一般在0.5 ü MG - 1固体，EC 3.1.3.2）
型酸性磷酸酶IV - S的马铃薯 （土豆，PP，一般4.6 ü MG - 1固体，EC 3.1.3.2）
*活动单位的指定供应商1单位定义为磷酸盐解决每小时1微摩尔的解放，在37 ° C。 - 复溶冻干从桔青霉 （真菌; NP1，一般在500 U 毫克 -1固体）核酸酶P1（EC 3.1.30.1）1毫升的去离子水，现在可以在4℃保存供日后使用。
- NP1;移液器，终浓度为2.5单位/毫升NP1在步骤3.2编写的10毫升管，轻轻混匀反相几次。
- 离心30分钟，两个10毫升酶解决方案3000 XG。
4。 P校准曲线和控制
- 准备1升1 mM磷酸钾（K2HPO4，174.18克/摩尔）原液。
- 1毫米的磷酸钾储备液1.5 mL离心管中加入1 mL和执行700 0.5毫升系列稀释。
- 弃管头，让你有7个稀释度范围从20 nmol 0.625 nmol P.
- 传输从每管80μL，在重复的行乙 - h的一个标准96孔板。
- 添加醋酸钠缓冲液（3.1节）80μL行列第11和12，这是0 nmol P校准点。
- 现在每列11和12包含8 0 nmol，20 nmol无机磷的参考样本。
- 第10栏将包含以下控件：
- 加入40μLPP + GP酶液+ 40μL醋酸钠缓冲液（3.1节）第10栏的前三个井。
- 添加40μL聚丙烯+ GP + NP1酶液+ 40μL的醋酸钠缓冲到下一个三口井。
- 添加40μL的醋酸钠溶液中含有10 nmol葡萄糖6磷酸（C 6 H 11的Na 2 O 9个 P • XH 2 O，304.1克/摩尔）40μL聚丙烯+ GP酶液和最终以及在第10栏添加醋酸钠代替酶液的解决方案。
5。样品+酶孵化
- 每个被测试的样本，将占据在一个标准的96孔板的1行的第9口井。
- 从第2井1-9多达8行40μLpH值调整后的样本提取物分发。
- 毕竟样品已派发*使用多道移液器分发PP + GP酶液1-3列，PP + GP + NP1列4-6和醋酸钠缓冲液（3.1节准备）列7-9。
*这一步必须快速进行，以确保所有的样品得到相当于孵化时间。 - 盖有盖和孵育96孔板+酶的解决方案，控制在37和校准曲线刚好1小时° C。
6。释放和背景无机磷的色度测量
- 准备50毫升去离子水，下面的解决方案：
*解决方案：0.1 M的抗坏血酸（C6H8O6，176.12克/摩尔）+ 0.5M三氯乙酸（Cl3CCOOH，163.39克/摩尔）
B液：0.01 mol钼酸铵（（NH4）2MoO4，196.01克/摩尔）
溶液C：0.1M柠檬酸钠（（COONa）（CH2COONa）2 2H2O，294.10克/摩尔）+ 0.2 M钠砷酸（NaAsO2，129.91克/摩尔）+ 5％冰醋酸酸
（CH3CO2H，60.05克/摩尔）*解决一个每天必须做好准备。 - 添加25μL溶液SDS 100μL溶液A，B液和50μL和20μL溶液C的所有井在96 - PL吃。迅速与多道移液器。
- 覆盖板，并在室温下孵育30分钟。
- 在任何可调微酶标仪850 nm处测量吸光度。
7。磷化合物的分类
- 原始数据导入到电子表格应用程序（如Microsoft Excel）。
- 剧情无机磷校准曲线：在X轴的0至40 nmol P和Y轴重复的吸光度测量平均。
- 进行线性回归，并寻找最佳拟合线方程。
- 列1-3：直接适用的校准曲线，这是背景无机体育
- 列4-6：平均一式三份样本值，减去从总吸收，这是P水解P单酯衍生的控制（酶液+背景的无机磷）。
- 列7-9：与7.5相同，但减去吸光度值列4-6 - 这是从水解P酯P。
- 吸光度数据转换nmol P应用的校准方程发布。
- nmol P发布，可与毫克/公斤的原土。此外，评估每个P类的比例，也可能是一个有用的方法分析数据。
8。代表性的成果：
快速目视检查后96孔板比色化学，将提供程序是否正确执行的线索。首先要检查的液体在每口井的水平扫描板的侧面。应该有整整275μL试剂在所有井。下一步，目视检查一式三份样品孔的颜色和重复校准水井。这些技术的复制应该是相同的蓝色色调。下一步申请校准曲线含葡萄糖6磷酸的两口井，并确认他们发行后总提取P所有10 nmol无机体育已测使用ICP - OES或一种替代方法，确保使用这个值来计算的总P协议不超过P的提取量。
注：认真在电子表格中的数据管理，将有助于对定量错误的后卫。一次，您将处理大量的数字，所以创建一个模板，将花费的时间。
图1显示8个样品（行AH）和校准曲线（列11和12）的结果的96孔板。控制在10列。列1-3和4-6之间的颜色强度的增加是由于水解酯P化合物，列4-6和7-9之间，是由于水解酯P化合物。
图2，一个0.25米的NaOH - 0.05 M EDTA佛蒙特州土壤样本，采用高通量酶解提取的P类分布。误差线表示标准偏差，N = 3。
Discussion
就其性质而言，快速的方法，使用小容量，需要格外小心。因此，最重要的步骤是那些涉及到的板块吹打解决方案。准确，和最重要的，一致的吸管技术的是这个实验的成功至关重要。
的NaOH - EDTA的提取将使大部分在许多样品的p特点分为三类：磷酸盐，P单酯和双酯体育土壤，肥，沉积物或任何其他环境样品中含有氢氧化钠提取的P - EDTA可以特点。环境样品中的P形式不一定是稳定的，这种技术将确保样品的特点，样品前妥协，而无需聘用的研究人员的军队。
这个实验是特别适合时要处理大量的样品。该试剂的需求和空间的要求已经缩减到一个可控的水平（如1.5毫升离心管，而不是50 mL的玻璃烧瓶）。这种适应也限制了废物的产生。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢美国地质调查局和佛蒙特水资源湖和研究中心提供资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 242853 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Wheat Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P3627 | |
| Potato Acid Phosphatase | Sigma-Aldrich | P1146 | |
| Nuclease P1 | Sigma-Aldrich | N8630 | |
| Potassium Phosphate | Sigma-Aldrich | P2222 | |
| Glucose-6 Phosphate | Sigma-Aldrich | G7250 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4390 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
| Ammonium Molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S1804 | |
| Sodium Arsenate | Sigma-Aldrich | S9663 |
References
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