脑浸润性白细胞的分离

摘要

介绍了一种从小鼠脑组织中快速获取浸润性白细胞的方法。该方法利用连续Percoll梯度和不连续Ficoll梯度，选择并纯化富含白细胞的组分层。分离得到的白细胞随后可通过流式细胞术进行表征分析。

摘要

我们描述了一种从小鼠中制备脑浸润性白细胞（BILs）的方法。我们展示了如何通过快速颅内注射技术将鼠脑心肌炎病毒（Theiler's murine encephalomyelitis virus, TMEV）感染小鼠，以及如何从全脑组织中纯化出富含白细胞的浸润细胞群体。简言之，将小鼠置于密闭舱内用异氟烷麻醉后，使用哈密尔顿注射器直接手动注射至额叶皮层。感染后不同时间点，通过过量异氟烷麻醉处死小鼠，取出全脑组织，并用Tenbroeck组织研磨器在RPMI培养基中进行匀浆。脑匀浆液经连续30% Percoll梯度离心，以去除髓鞘及其他细胞碎片。细胞悬液随后经40 μm细胞筛过滤，洗涤后在不连续Ficoll-Paque Plus梯度液中离心，以富集并纯化白细胞。所得白细胞经洗涤后重悬于适当缓冲液中，用于流式细胞术免疫表型分析。流式细胞术结果显示，在感染早期阶段，C57BL/6小鼠脑内存在一群天然免疫细胞。感染后24小时，BILs中出现多种免疫细胞亚群，其中以Gr1⁺、CD11b⁺和F4/80⁺细胞群体显著富集。因此，该方法适用于表征脑内急性感染过程中的免疫应答反应。

方案

1. 颅内病毒注射：

本实验技术已由本实验室及同行进行了修改并广泛使用。简言之，对年轻小鼠（优选5-6周龄）进行颅内注射Theiler's小鼠脑脊髓炎病毒Daniel株（TMEV）或假感染（1, 10），以诱导脑组织浸润性白细胞（BILs）的产生。请注意，Daniel株、BeAN株和GDVII株所获得的结果会有所不同。为获取BILs，小鼠接种2×10⁵ PFU的TMEV，并感染24小时。

1. 将注射针头（27 号，¼ 英寸，Kendall）连接至自动 1 ml Hamilton 注射器，并设定递送 10 μl 病毒液。
2. 小心吸取含 TMEV 的 10 μl DMEM 液体至注射器中，注意避免气泡产生。在适当情况下，假感染小鼠注射 10 μl 无病毒 DMEM。
3. 注射前，将约 1 mL 异氟烷倒入含有带棉垫底层金属网格的钟形罩内。
4. 将小鼠直接置于钟形罩内的金属网格上，直至其轻度麻醉，对足趾夹捏无反应且因吸入麻醉剂而固定不动，约需 10–15 秒。小鼠不应直接接触异氟烷，因该物质可能具有刺激性和腐蚀性。
5. 在麻醉状态下，通过剃毛和染色快速定位颅骨额叶皮层区域的适当坐标以准备注射。注射的一般位置为前囟前 1 mm，矢状缝右侧 1 mm 处（图 1）。尽管立体定位注射适用于某些实验情况，但我们发现大多数实验中无需剃毛或染色，采用徒手注射即可。沿两个轴方向用针尖分开毛发即....

讨论

我们常规使用流式细胞术来评估脑部浸润细胞制备的质量，并区分不同类型的免疫细胞^{2, 9}。在急性期时间点，我们的BILs方法在CD45hi群体中获得较高比例的炎性单核细胞，同时在CD45lo群体中获得较高比例的巨噬细胞。这表明，通过我们的方法可稳定、可靠地表征脑内可重复的免疫反应。

该技术对于需要从小鼠脑组织中获取特征明确的免疫细胞群体的实验尤为重要。我们此前已通过尾静脉注射，将分离得到的脑浸润性白细胞转移至受体小鼠体内，成功开展了过继转移实验。 ⁷，并通过多种方法对BILs进行了表征 体外 实验 ⁹我们的BILs制备方法在需要区分脑内不同免疫细胞群体与常驻脑细胞（包括常驻巨噬细胞和小胶质细胞）的实验中尤为有益。另一项值得关注的应用包括在感染后第7天对从BILs中分离的总RNA进行实时RT-PCR分析，以鉴定效应功能。 ³例如，我们检测了感染TMEV后第7天从穿孔素功能正常和穿孔素缺陷动物中分离的脑浸润淋巴细胞（BILs）中GAPDH、颗粒酶B和穿孔素的RNA水平。我们还利用BIL.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
TMEV	Howe 实验室	N/A
Daniel’s 菌株	Invitrogen	21063-029
异氟烷	Novaplus	NDC 0409-3292-49
圆底 Oak Ridge 离心管	Nalge Nunc 国际公司	3118-0030
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Percoll	GE 医疗集团	17-0891-02
10X PBS	罗氏集团	11666789001
Ficoll-Paque Plus	GE 医疗集团	17-1440-02
台盼蓝 0.4% (w/v)	Mediatech, Inc.	25-900-CI
15 ml 圆锥形离心管	BD 生物科学公司	352097
7 mL 玻璃 Pyrex 品牌 Tenbr–ck 组织研磨器	费舍尔科技公司	08-414-10B
40 μm 细胞筛	BD 生物科学公司	352340
50 mL 圆锥形离心管	BD 生物科学公司	352070
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9647
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S8032
CMF-PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
FACS 管	BD 生物科学公司	352054
胎牛血清	Sigma-Aldrich	F4135
2.4G2 杂交瘤细胞	ATCC	HB-197
Costar V 型底板	Corning	3894
Allegra X-22R 离心机或同等设备	贝克曼库尔特公司	N/A
96 孔板桶和转子	贝克曼库尔特公司	S2096
固定角转子	贝克曼库尔特公司	F0360
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148
BD FACS Calibur	BD 生物科学公司	N/A
FlowJo 7.5	Tree Star, Inc.	N/A
CD45	BD 生物科学公司	557235	克隆号：30-F11
Gr1 (Ly6C/G)	BD 生物科学公司	553128	克隆号：RB6-8C5
CD11b	eBioscience	17-0112-83	克隆号：M1/70
F4/80	eBioscience	17-4801-82	克隆号：BM8