Summary

Isolamento di Brain-infiltrazione Leucociti

Published: June 13, 2011
doi:

Summary

Un metodo rapido per ottenere leucociti infiltrati dal cervello murino è descritto. Questo metodo utilizza una pendenza costante Percoll e gradiente discontinuo di Ficoll selezionare e purificare i leucociti arricchito strato. Leucociti isolati può quindi essere caratterizzata da misure di citometria a flusso.

Abstract

Descriviamo un metodo per la preparazione di leucociti cervello infiltrante (Bils) dai topi. Noi dimostrare come infettare topi con encefalomielite Theiler ha murino virus (TMEV) attraverso una tecnica rapida iniezione intracranica e come purificare un leucociti arricchito popolazione di cellule infiltrati dalla intero cervello. In breve, i topi vengono anestetizzati con isoflurano in una camera chiusa e sono a mano libera iniettato con una siringa Hamilton nella corteccia frontale. I topi sono poi uccisi in vari momenti dopo l'infezione da overdose isoflurano e cervelli interi vengono estratti e omogeneizzato in RPMI con una smerigliatrice tessuto Tenbroeck. Omogenati cerebrali sono centrifugate con una pendenza costante Percoll 30% per rimuovere i detriti cellulari mielina e gli altri. La sospensione cellulare viene quindi filtrato a 40 micron, lavato e centrifugato su un discontinuo Ficoll-Paque Plus. gradiente di selezionare e purificare i leucociti. I leucociti vengono poi lavate e risospese in buffer appropriato per immunofenotipizzazione mediante citometria di flusso. Citometria a flusso rivela una popolazione di cellule del sistema immunitario innato nelle fasi precoci dell'infezione nei topi C57BL / 6. A 24 ore dopo l'infezione, più sottoinsiemi di cellule immunitarie sono presenti nel Bils, con una popolazione arricchita del Gr1 +, CD11b F4/80 + + e cellule. Pertanto, questo metodo è utile per caratterizzare la risposta immunitaria alle infezioni acute del cervello.

Protocol

1. Virus iniezione intracranica: La seguente tecnica è stato modificato ed utilizzato ampiamente dal nostro laboratorio e colleghi. In breve, l'iniezione di tensione intracranica Daniel di Theiler ha murino encefalomielite virus (TMEV) o sham-infezione (1, 10) viene eseguita su topi giovani (preferibilmente 5-6 settimane di età), per sollecitare leucociti cervello infiltrante (Bils). Si prega di notare che i risultati saranno diversi tra il ceppo di Daniel, il ceppo BEAN, e il ceppo GDVI…

Discussion

Noi abitualmente uso di citometria a flusso per determinare sia la qualità della preparazione infiltrazione delle cellule cerebrali, e per distinguere le diverse popolazioni di cellule immunitarie 2, 9. Al acuta intervalli di tempo, il nostro metodo Bils rese elevate percentuali di monociti infiammatorio all'interno della popolazione CD45hi così come alte percentuali di macrofagi nella popolazione CD45lo. Ciò indica che una risposta immunitaria riproducibile all'interno del cervello possono essere …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione NS64571 dal NINDS (CLH), con un premio primi stadi dello sviluppo della carriera della Mayo Clinic (CLH), e da un generoso regalo di Donald e Frances Herdrich (CLH). Vorremmo ringraziare il Core Mayo Clinic Citometria a flusso per l'assistenza.

Materials

Reagent Company Catalog number Comments
TMEV Howe Lab N/A  
Daniel’s strain Invitrogen 21063-029  
isoflurane Novaplus NDC 0409-3292-49  
round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes Nalgene 3118-0030  
RPMI 1640 Invitrogen 11875-093  
Percoll GE Healthcare 17-0891-02  
10X PBS Roche 11666789001  
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02  
Trypan Blue 0.4% (w/v) Mediatech 25-900-CI  
15 ml conical tubes BD Falcon 352097  
7 mL glass Pyrex brand Tenbroeck tissue grinder Fisher 08-414-10B  
40 μm cell strainer BD Falcon 352340  
50 mL conical BD Falcon 352070  
bovine serum albumin Sigma A9647  
sodium azide Sigma S8032  
CMF-PBS Mediatech 21-040-CV  
FACS tubes BD Falcon 352054  
fetal bovine serum Sigma F4135  
2.4G2 hybridoma ATCC HB-197  
Costar V-bottom plate Corning 3894  
Allegra X-22R centrifuge or equivalent Beckman N/A  
96-well plate bucket and rotor Beckman S2096  
Fixed-angle rotor Beckman F0360  
paraformaldehyde Sigma P6148  
BD FACS Calibur BD Biosciences N/A  
FlowJo 7.5 Tree Star, Inc. N/A  
CD45 BD Biosciences 557235 clone: 30-F11
Gr1 (Ly6C/G) BD Biosciences 553128 clone: RB6-8C5
CD11b ebiosciences 17-0112-83 clone: M1/70
F4/80 ebiosciences 17-4801-82 clone: BM8

References

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Cite This Article
LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747, doi:10.3791/2747 (2011).

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