在早期鸡胚上放置包被生长因子的微珠

摘要

多种生长因子和蛋白质相互作用，诱导细胞在发育过程中分化为不同的细胞命运。在此，我们通过在E2.5鸡胚上放置含有蛋白的琼脂糖珠，展示如何利用鸡胚内实验体系来研究不同蛋白质在发育过程中的潜在相互作用。

摘要

在发育过程中，神经管以特定的时空模式表达多种蛋白质。这些蛋白质已被证实对细胞命运决定、细胞迁移以及神经环路的形成至关重要。神经元诱导和模式形成涉及骨形态发生蛋白（BMP）、 sonic hedgehog（SHH）、成纤维细胞生长因子（FGF）等多种因子。特别是，Fgf8 的表达模式与表达 BMP4 和 SHH 的区域相邻。这种表达模式与促进端脑模式形成的发育相互作用相一致。

本文提供了一种可视化演示方法，可用于在鸡胚内（in ovo）研究成纤维细胞生长因子（Fgfs）在前脑形成过程中的作用。将蛋白包被的琼脂糖珠植入发育中的神经管内，以实现持续的蛋白暴露。由于该操作使用体积微小且定位精确的琼脂糖珠，因此侵入性极小，并可在单个神经管内放置多个琼脂糖珠。此外，该方法允许胚胎继续发育，从而可在更成熟的发育阶段对胚胎进行分析，以检测解剖结构和神经图式的变化。这一简单而实用的实验方案支持实时成像，提供了一种在空间和时间上对内源性蛋白水平进行有限调控的手段。

方案

1. 从培养箱中取出卵

在E2-2.5（约HH 17期）时取出鸡蛋，并进行相应处理。可立即进行操作，也可将鸡蛋放回孵育箱中数小时。鸡蛋在室温下安全放置超过一小时是可行的。在操作期间，鸡蛋可一直置于孵育箱外。有时这些操作可能需要一小时或更长时间。

注意：在室温下放置的时间越长，其存活的可能性越低。

2. 墨汁的制备

1. 配制新鲜的4%印度墨水无菌PBS溶液。
2. 用该溶液填充一支3 mL注射器。
3. 在注射器上安装一根27号、½英寸长的针头。
4. 使用止血钳将针头弯曲成90°角。

3. 打开卵壳并注射印度墨水

1. 用一对镊子掀开胶带，打开观察窗，并将胶带反面贴在蛋的背面以固定窗口。
2. 引导斜角针头进入，使其刚好位于胚胎下方。将针头置于漂浮的胚盘下方，可确保墨水（对胚胎有毒性）不会直接接触胚胎。
3. 只需注射足量墨水以产生清晰的对比度即可，通常少于¼ mL。

4. 打开神经管

1. 取一把精细解剖剪，剪开位于胚胎上方或有时环绕胚胎的薄层膜结构。
2. 使用一对55号镊子或钨针，从后向前打开神经管。确保切口足够大，以便将小珠置入其中。

注意：根据年龄的不同，可使用精细的钨针完成相同操作。

5. 获取包被的肝素-丙烯酸珠

1. 使用一对55号镊子，在溶液中找到一颗完整的珠子。让珠子自行附着在镊尖上，然后缓慢闭合镊子。
2. 将珠子从溶液中取出，并移至卵的上方。
3. 一旦珠子离开其溶液，除非放入蛋清中，否则不易脱落。

6. 放置微珠

1. 将微珠放置在目标区域上方后，使用钨探针将其引导至前脑或固定在后脑。
2. 使用10 µL移液器加入少量PBS。

7. 封闭卵壳

1. 使用一小条胶带将窗口封闭，合上蛋壳。
2. 按照预处理方案密封蛋壳，方案详见 https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306。

讨论

根据您希望使用的蛋白质种类，有不同的方案用于制备微珠。在这些实验中，我们使用肝素-丙烯酸微珠，但也可使用Affi-Gel微珠。我们发现肝素-丙烯酸微珠在卵白蛋白的水性环境中更容易操作。微珠在4°C下用5 µL蛋白溶液浸泡过夜。对照组微珠则置于无菌PBS中，直至植入时使用。使用鸡胚体内实验体系的优势在于胚胎仍存活，并可正常发育¹。尽管外植体所处的环境可针对特定变量进行控制，但活体胚胎能够更准确地反映蛋白质对发育模式的影响^2-3。所有适用于外植体的检测方法，均可应用于胚胎。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鸡蛋	动物			已受精，E2-2.5（约 HH St. 17）
培养箱	Profi-I	Lyon
印度墨水	工具	Higgins		用无菌 PBS 配制 4% 溶液。
无菌 PBS				也可使用抗体混合物
1 ml 注射器
27G 1/2 针头	工具	BD Biosciences	305109	成 90 度角
镊子	工具	World Precision Instruments, Inc.		55 号
止血钳
解剖剪刀	工具	World Precision Instruments, Inc.	500086	vannas 型，8.5 cm
Parafilm 膜				用于密封鸡蛋
钨针	工具	Electron Microscopy Sciences	62091	工具 #24，手柄可选。