Summary
이 방법은 EpiAirways, 공기 - 액체 인터페이스에서 성장 기본 인간의 호흡기 상피 조직, 생물학 관련 공동 문화 확장 박테리아의 특성을 허용
Abstract
2; Nontypeable 헤모필러스 인플루엔자 (NTHi)는 호흡기 점막 1 반복 및 만성 감염을 일으킬 수 인간 적응 그람 음성 세균 있습니다. 이러한 생물은 호흡 조직 및 내부 생존하는 메커니즘, 박테리아와 인간 세포의 성공적인 장기 협력 문화가 필요합니다 수행할 수있는 모델을 연구한다. 우리는 공기 - 액체 인터페이스에 제기된 주요 인간의 호흡기 상피 조직을 사용 EpiAirway 모델 (MatTek, 애쉬 랜드, MA). 이들은 꽉 분기점, 속눈썹이있는 세포와 nonciliated, mucin를 생산하고, 감염에 대한 응답으로 크린 시토킨를 생산하는 능력을 유지 고블렛 세포를 포함하지 않는 불후의, 잘 차별, 3 차원 조직입니다.
인간 상부기도의 체외 모델에서 본 생물학 관련은 여러 가지 방법으로 사용할 수 있으며이 방법의 전반적인 목표는 시간이 지남에 따라 NTHi과 quantitate와 EpiAirway 조직의 장기 공동 문화 셀 - 관련 및 internalized 박테리아를 수행하는 것입니다 . 뿐만 아니라, 공동 문화 감염의 mucin 생산 및 시토킨 프로필이 결정하실 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 많은 현재의 프로토콜의 기존 방법에 따라 개선 연장 기간 세 이상의 세균 감염을 지원하지 않습니다 인간의 세포의 잠수 monolayer 또는 트랜 스웰 문화를 사용합니다. 유기체가 overlying 미디어에 복제할 수있다면 예를 들어,이 실험을 체포, 세포 독성 및 호스트 세포의 손실 허용되지 않는 수준이 발생할 수 있습니다. EpiAirway 모델은 장기 호스트 병원체 상호 작용의 특성을 허용합니다. EpiAirway에 대한 소스가 오히려 불후의 라인보다 일반적인 인간 tracheo - 기관지 세포이기 때문에 또한, 각 구조와 기능 4 모두 실제 인간의 상부 호흡기 트랙트 조직의 훌륭한 표현이다.
이 방법은 EpiAirway 조직은 이전에 배달 2 일 안티 - 미생물 및 안티 곰팡이 화합물의 젖을에서, 모든 절차는 항생제가없는 조건에서 수행됩니다. 이것은 모두 박테리아와 인간의 기본 조직은 동일한 biosafety 캐비닛에 사용되므로, 특별 고려 사항을 요구하고, 오랜 시간 동안 공동 양식입니다.
Protocol
1. EpiAirway 조직에 대한 biosafety 캐비닛 준비
- 다시 장갑 묶인 머리, 전용 실험 복을 입고, 층류를 시작합니다. 오분 후, 한쪽으로 캐비닛 (pipettors, 팁, 원심 분리기 튜브 등)에 도구를 이동, 스프레이 70 % 에탄올과 깨끗한 종이 타월로 닦아 아래와 biosafety 캐비닛 내부 및 창틀. 70 % 에탄올로 다시 청소 인테리어 스프레이 건조에 둡니다. 깨끗한쪽으로 도구를 이동하고 에탄올 절차를 반복하십시오.
- 캐비닛의 에어로졸 장벽 피펫 팁 및 전용 pipettors을 사용합니다. 개별 포장된 멸균 serological pipettes를 사용하려면, 폐기 포장 밖을 층류를 통해 연결 끝에 합격 깨면, 그리고 캐비닛에 피펫을 슬라이드.
- EpiAirway 삽입은 무균 포셉으로 취급해야합니다. 플레이스 6 인치 미세 팁 곡선 자체 밀봉 살균 파우치와 압력솥에 집게를 해부. 사용하기 위해 최소한 6 하루 준비가있을 정도로 준비합니다.
2. EpiAirway 조직을 풀고
- 70 % 에탄올로 biosafety 캐비닛에 작업 표면을 스프레이 깨끗한 종이 타월로 아래로 닦으십시오. 다시 스프레이와 표면을 사용하기 전에 건조 수 있습니다. EpiAirway 상자를 열고 스티로폼과 포장 재료를 폐기하십시오.
- EpiAirway 항생제없는 유지 보수 언론, AIR - 100 - MM ABF (MM)는 MatTek 독점하고 삽입과 키트에 전송됩니다. biosafety 캐비닛, 미디어 유형과 날짜와 라벨이 여섯 무균 50 ML의 원심 분리기 튜브를하고 뚜껑을 느슨하게에. 70 % 에탄올로 미디어 병을 스프레이와 캐비닛 내부 엽니다. 각각의 튜브에 대한 새 살균 serological 피펫을 사용하여 각 튜브로 나누어지는 MM 25 ML, 4 ° C.에있는 뚜껑과 상점을 강화 매일 MM의 신선한 나누어지는을 사용합니다.
- 1 X Dulbecco의 새로운 병 인산염 버퍼 칼슘, 마그네슘과 호수 (D - PBS)를 사용하여 위의 2.2를 반복합니다. 칼슘, 마그네슘없이 D - PBS를 사용하여 다시 반복합니다. 4 모든 aliquots를 저장 ° C.
- EpiAirway 삽입 AIR - 100 ° C 고체 미디어 포함된 아가로 오스를 4에서 24 잘 판에 도착하고, 사용을위한 6 자 접시에 배치해야합니다. 에탄올 방지 마커를 사용하여 날짜와 설명 각 접시 라벨. 각 우물에 4 ° C EpiAirway의 MM 장소 1 밀리리터. 포장, 70 % 에탄올로 스프레이하고, biosafety 캐비닛의 위치에서 전송 플레이트를 제거합니다. 테이프를 제거하고 접시를 엽니다. autoclaved 집게를 사용하여 EpiAirway 삽입 위에 젖은 거즈를 제거합니다.
- 6 잘 판의 우물에 아가로 오스에서 출시에 도움을 왜곡 움직임을 사용하여 autoclaved 포셉로 삽입하고, 장소를 선택하십시오. 어떤 아가로 오스는 전송 판의 온도가 주위에 증가 특히 같이 삽입을 준수합니다. 조심스럽게 삽입에서 아가로 오스를 제거하는 살균 면봉을 사용합니다. 멤브레인를 감동하지 않도록하고, 기포가가 삽입 아래에 갇혀 있지 않은지 확인하십시오. 5% CO 2 humidified 37 ° C 배양기에 플레이트를 놓습니다.
- 공동 문화를 시작하기 전에 인큐베이터에서 평형에 조직을 위해 최소 24 시간을 허용하십시오.
3. EpiAirway 조직의 유지 보수
- autoclaved 집게를 사용하여 삽입을 선택하고 부드럽게 조직에 칼슘과 마그네슘으로 미리 예열 D - PBS 200 microliters을 피펫하고 삽입을 바위. 각도로 삽입을 기울이기 및 삽입의 하단에있는 멤브레인를 보유하고있는 플라스틱 고리로부터 무균 P1000의 피펫 팁을 넣으십시오. 조직을 만지지 마십시오. D - PBS는 씻어 표시 살균 cryovial에 장소 대기음. 샘플은 -20 ° C에서 냉동하고 나중에 mucin 및 / 또는 시토킨 표현 assayed 수 있습니다.
- aspirating 신선한 MM 1 밀리리터로 대체하여 매일 기초 MM을 변경합니다. 각 잘에 대한 새 벽 피펫 팁을 사용합니다. 하루 10 %의 표백제로 사용되는 미디어를 취급하고 폐기.
4. EpiAirway 조직의 접종
- 초콜릿 한천에 냉동 글리세롤 주식의 nontypeable 헤모필러스 인플루엔자 (NTHi)의 새로운 문화를 밖으로 승리. humidified 5% CO 2 배양기에서 하룻밤 성장.
- 그 다음날, 약 0.7의 OD (600 NM)에 칼슘과 마그네슘으로 미리 예열 D - PBS에서 NTHi의 한 식민지 resuspend. 적극적으로 사전 광학 밀도를 측정하는 소용돌이. 로 광학 밀도의 관계 식민지 - 성형 NTHi의 ML (CFU / ML) 단위당 것은 0.2의 OD가 (600 NM) 약 1.0 × 10 8 CFU / ML과 상통한다는 것입니다. 따라서 0.7의 OD (600 NM)는 3.5에 대한 X 10 8 CFU / ML입니다. 이 알고리즘은 접종하기 전에 각 NTHi 변형에 대한 검증해야합니다.
- EpiAirway 조직은 AIR - 100는 0.6 cm 2 0.4 미크론 막의 표면적과 삽입에 성장하고 있습니다. 조직은 ~ 8.0 × 10 5 ~ 1.0 × 10 6 구성되어있다 </> 세포를 한모금. 12 - 따라서, 1.0 X 10 7 CFU의 접종 약 10 감염의 다중성에 해당합니다. 예방, 3.1에서와 같이 각 EpiAirway 삽입을 린스, 다음 biosafety 캐비닛의 각 EpiAirway 인서트의 혀끝의 표면에 4.2 준비 세균성 정지 28 microliters를 추가합니다. 기초 MM의 예방하지 마십시오. 보육 각 접시를 반환합니다.
5. NTHi inoculum의 부량
- 소독으로 0.1 % 젤라틴 (PBS - G), 압력솥과 인산염 버퍼 호수 (PBS) 솔루션을 준비합니다. 각각의 튜브에 멸균 PBS - G의 inoculum과 나누어지는 900 microliters의 OD (600 NM)에 따라 원하는 1시 10분의 dilutions와 라벨 멸균 1.5 ML Eppendorf 튜브.
- 주사 NTHi를 열거하는 데 필요한 초콜릿 한천 플레이트의 수를 결정합니다. 한 시간 만이라도 상단의 절반에 휴식 접시의 바닥과 거꾸로 공기 인큐베이터에서 이러한 접시를 놓습니다. 이것은 접시가 모두 37 따뜻한 ° C와 NTHi의 드롭 도금을 촉진, 건조 표면.하실 수 있습니다
- 4.2에서 첫 번째 튜브로 세균성 정지 100 microliters을 추가하여 inoculum의 일련 1시 10분 dilutions를 시작합니다. 와동은 각 희석을 다해 5 초 동안 이전 다음 서비스를 제공하는 방법을. 각 희석의 절반 접시를 사용하여 미리 예열 및 표면 건조 초콜릿 한천 플레이트에 10 microliter의 aliquots 버려. 5 ~ 6 10 microliter의 aliquots 함께 실행하지 않고 각 100mm 판의 절반에 들어갈 수 있습니다. 언제 거꾸로 humidified 37 건조, 장소 ° C CO 2 배양기 하룻밤.
- 그 다음날, 각 드롭 15-30 뚜렷한 식민지를 dilutions을 계산하고 NTHi의 실제 가능한 inoculum 다시 계산하여 CFU / ML을 결정합니다.
6. NTHi와 장기 공동 문화
- 다음, -20에서 박테리아와 동결 같은 변형 ° 향후 분석을 위해 표시 cryovial에 C와 주사되어 각 조직의 세탁을 풀 3.1에서와 같이 24 시간마다는 삽입 씻으십시오. 이 샘플은 도트 blots에 의해 mucin의 존재 또는 엘리사에 의해 크린 시토킨의 표현에 대한 assayed 수 있습니다. 또한, 조직은 mRNA에 대한 수확 수 있으며 qPCR는 관심의 유전자에 수행할 수 있습니다. 3.2에서와 같이 매일 기초 MM을 변경합니다. 공동 문화의 기간 동안 계속합니다.
7. EpiAirway 조직의 수확
- 칼슘, 마그네슘없이 D - PBS에서 사포닌의 신선한 1 % 솔루션을 준비, 필터 소독 및 37 ° C.에 따뜻한
- 37 ° C.에 칼슘, 마그네슘없이 MM 및 D - PBS의 다른 50 ML 튜브를 따뜻하게
- 5.1로 희석 튜브를 준비뿐만 아니라 삽입 번호와 NTHi 변형으로 표시 삽입 당 하나의 빈 멸균 1.5 ML Eppendorf 튜브.
- EpiAirways은 자기편과 internalized 생물, 아니면 internalized 박테리아를 모두 포함하는 총 셀 관련 박테리아 중 하나에 대한 수확 수 있습니다.
- 드롭 판 휴대 관련 또는 5.2과 같은 NTHi, 공기 인큐베이터에서 한 시간 동안 라벨과 건조를 침공. 필요한 초콜릿 한천 플레이트의 수를 결정
- 총 세포 관련 박테리아를 수확, 칼슘이나 마그네슘없이 D - PBS 200 microliters로 세 번 EpiAirways의 혀끝의 표면을 씻어 다음 삽입을 기울 및 기저 막에서 남아있는 MM를 헹굴. 최초의 세척은 나중에 분석을 위해 냉동 수 있으며 다음과 세척을 삭제.
- 각 조직의 꼭대기의 표면에 7.1에서 멸균 1퍼센트 사포닌 솔루션의 세탁 MM없이 신선한 6 잘 판에 삽입하고, 피펫 250 microliters를 놓습니다. 10 분 인큐베이터로 돌아가기.
- 인큐베이터에서 제거하고, 멸균 P1000 피펫 팁을 사용하여 사용하여 백업 및 규정 모션, 삽입의 가장자리에서 조직을 제거하는 원운동 다음을 막의 조직을 씻어. 큰 구멍 살균 P1000의 피펫 팁을 사용, 7.3에서 준비한 빈 튜브 라벨에 정지를 놓습니다. 삽입의 혀끝의 표면에 칼슘이나 마그네슘없이 D - PBS 250 microliters를 추가합니다.
- 수확으로 남아있는 조직이 있는지 확인하기 위해 거꾸로 위상 대비 현미경을 사용하여 삽입을 검사합니다. 필요한 경우, 다른 살균 P1000 피펫 팁로 다시 스크럽, 다음 큰 구멍 살균 P1000의 피펫 팁을 사용하여 7.8에서 관이 정지를 추가합니다. 칼슘이나 마그네슘없이 D - PBS를 사용하여 1 밀리리터로 튜브의 전체 볼륨을 가져와.
- 일분 최고 속도에 적극적으로 와동 세포 현탁액. 26 게이지 바늘로 장착되어 살균 한 ML의 주사기를 사용하여 주사 바늘을 통해 주사기로 정지를 대기음. 천천히 거품을 만들 수 없습니다 간병, 바늘 3 회를 통해 현탁액을 전달합니다. 일분 적극적으로 다시 소용돌이.
- 7 준비 첫 번째 희석 튜브에 큰 구멍 피펫 팁, 장소 정지 100 microliters을 사용합니다.3. 와동을 다해 초 동안 다음, 시리얼 1시 10분 dilutions합니다. 표면 건조 초콜릿 한천 플레이트에 드롭 판 원하는 dilutions.
- internalized 세균만을 수확, 칼슘이나 마그네슘없이 D - PBS 200 microliters 각각 삽입에게 3 회 씻는다. 첫 번째 세차를 유지하고 냉동. 100 마이크로 그램 / ML의 최종 농도로 미리 예열 MM에 gentamicin 황산을 추가합니다. 수확으로 삽입할 당 미디어 1.5 ML를 준비합니다. gentamicin 함유 MM과 기초 MM를 교체하고, 혀끝의 표면에 gentamicin 함유 MM 300 microliters를 추가합니다. 한 시간 만이라도 다시 CO 2 배양기에 플레이트를 놓습니다.
- 혀끝의 표면에서 gentamicin 함유 MM를 제거하고 혀끝의 표면과 칼슘, 마그네슘없이 사전 예열 D - PBS로 광범위하게 삽입 기저 막 씻는다. 7.7-7.11와 같이 진행합니다.
8. 대표 결과 :
NTHi과 함께 5 일간의 공동 문화를 후 (A.) 감염되지 않은 EpiAirway 조직 및 (B.) 조직의 전자 micrographs를 스캔은 그림 1에 표시됩니다. NTHi와 장기 공동 문화가 혀끝의에 상당한 손상되지 않습니다 조직, EpiAirway 모델의 유틸리티를 강조. 조직 내부 시간이 지남에 따라 계량 internalized 박테리아의 숫자를 묘사한 그래프는 그림 2에 표시됩니다. 두 결과가 매우 재현할 수 있으며, EpiAirway 조직하고 일관성 있고 인간 상부기도의 체외 모델에서 생물학 관련 공부하는 NTHi 호스트 병원체 상호 작용.
그림 1. EpiAirway 조직의 전자 현미경을 검사합니다. A. 감염되지 않은 제어 조직. NTHi 공동 문화의 5 일 후에 B. 조직. 혀끝의 표면에 대한 중대한 손상은 감염 조직에서 관찰되지 않습니다.
그림 2. NTHi 개수 EpiAirway의 공동 문화 중에 시간이 지남에 따라 internalized. 스트레인 R2866은 다음 각 지정된 시점에서 internalized 박테리아에 대한 수확 약 1.0 X 10 7 CFU / 삽입 (데이 0)에서 주사를했다. 바 = 3이 최소한의 중복 복제 N를 나타냅니다. 오류 막대는 SD 있습니다.
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Discussion
이 방법은 허용하는 공기 - 액체 인터페이스에서 기본 인간의 호흡기 조직의 생물학 관련 배경으로 장기 호스트 병원체 상호 작용의 조사. 여기서 우리는 감염 유기체로 NTHi를 사용해야하지만, 시간이 지남에 따라 허용되지 않는 세포 독성을 소개하지 않는 박테리아의 상호 작용이 방법으로 계량하실 수 있습니다. EpiAirway 모델은 또한 바이러스, 약물, 또는 화학 물질에 영향을 인간의 상부기도 5의 연구에 사용될 수 있습니다, 6, 7, 8. 우리는 적어도 10 일간 NTHi에 감염된 40 개 이상의 일, 그리고 조직에 대한 감염되지 않은 조직을 유지했습니다. 우리는 원하는 경우에 감염된 조직이 크게 오래 유지 될 수 있다고 기대합니다.
이 방법의 한계 reconstitute 이러한 조직에서 유능한 면역 체계를 무능력을 포함하여 체외 모델에서, 그 비슷합니다. 조직의 일상적인 세척이이 조직에서 생산되는 mucin의 자연 콘센트를 설립, 정상 mucociliary 허가를 모방하기 위해 수행하고 있지만 아홉 더 바람직한 것이다. 또한, 문제가 10 exacerbating, NTHi는 인간의 호흡기 상피 세포의 mucin 표현을 유도하는 것으로 알려져로 문의하시기 바랍니다. 반면에, 매일 EpiAirway의 세척을 저장할 수 있으며 방법에 중요한 차원을 추가하고 그 유용성을 증가, 단백질이나 관심있는 효소 활동 assayed.
이 방법의 성공적인 성능을 한 핵심 단계는 드롭 도금하기 전에 조직의 기계적 장애 NTHi (단계 7.10을)입니다. EpiAirways가 매우 차별화된 여러 세포 유형으로 구성되어 있기 때문에, 조직도 사포닌 치료 후 세포 monolayer로 분해하기 쉬운되지 않습니다. 또한, NTHi는 조직의 disaggregation에 도움이되는 성분으로 악명 민감합니다. 따라서, 우리는 26 게이지 바늘을 통해 세포 현탁액을 통과하는 것은 크게 internalized 또는 휴대 관련 박테리아의 일관되고 반복 부량를 생성하는 능력을 향상 것으로 나타났습니다.
이 기술이 마스터되면, 그것은 또한 조사가 특정 유전자 돌연변이의 효과를 특징있게 그들의 야생 타입의 부모에 비해 생존을 위해 돌연변이 박테리아 변종의 상대 능력을 조사하기 위해 이용하실 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 도움이 토론 패트릭 헤이든 (MatTek)을 감사하고, 로버트 스미스와 그 EM 기술에 대한 조지아 보건 과학 대학의 리비 페리 것입니다. 이 연구는 아빠 NIDCD 부여 DC010187에 의해 투자되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium | Lonza Inc. | 17-513Q | |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium | Lonza Inc. | 17-515Q | |
| EpiAirway antibiotic-free tissues | MatTek Corp. | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway antibiotic-free maintenance media | MatTek Corp. | AIR-100-MM-ABF | Supplied with kit |
| 10X phosphate-buffered saline solution | EMD Millipore | 6506 | Dilute to 1X before use |
| Gelatin | JT Baker | 2124-01 | Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave |
| Difco GC Medium Base (chocolate agar) | VWR international | 90002-016 | Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C |
| BBL Hemoglobin (chocolate agar) | VWR international | 90000-662 | Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above |
| BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) | VWR international | 90000-414 | Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates |
| Dissecting forceps, fine tip, curved | VWR international | 82027-406 | |
| Self-sealing sterilization pouches | VWR international | 89140-802 | |
| Gentamicin sulfate, 10 mg/ml | Lonza Inc. | 17-519Z | Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill |
References
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