סריג מבוססי הכתבים משמשים יותר ויותר לעקוב אחר פעילות קינאז ו phosphatase בתאים חיים. כאן אנו מתארים שיטה כיצד להשתמש סריג מבוססי עיתונאים כדי להעריך את מחזור התא תלויות שינויים זירחון היעד.
Abstract
פורסטר תהודה העברת אנרגיה (סריג) מבוסס לכתבים 1 לאפשר הערכה של קינאז אנדוגני ופעילויות phosphatase בתאים חיים. בדיקות אלו בדרך כלל מורכבות של וריאנטים של CFP ו YFP, התערב על ידי רצף phosphorylatable ואת תחום phospho מחייב. לאחר זירחון, השינויים בדיקה הקונפורמציה, שתוצאתה שינוי המרחק או נטייה בין CFP ו YFP, מוביל לשינוי סריג יעילות (איור 1). מספר בדיקות פורסמו בעשור האחרון, מעקב אחר יתרת הפעילות של קינאזות ו phosphatases מרובות, כולל כתבים של 2 PKA, PKB 3, 4 PKC, PKD 5, 6 ERK, JNK 7, CDK 18, אורורה B 9 ו 9 Plk1 . בהתחשב עיצוב מודולרי, בדיקות נוספות צפויות לצאת ב 10 בעתיד הקרוב.
התקדמות דרך מחזור התא מושפע מתח signaling 11 מסלולים. יש לציין, מחזור התא מוסדר באופן שונה במהלך שאנן צמיחה לעומת כאשר התאים הם מחלים מתח 12. זמן לשגות הדמיה של התאים דרך מחזור התא ולכן מחייב זהירות מיוחדת. זה הופך לבעיה במיוחד כאשר העסקת הדמיה ratiometric, שכן שתי תמונות עם האות גבוה יחס רעש נדרשים לפרש את התוצאות. Ratiometric סריג הדמיה של מחזור התא משתנה תלוי בפעילות קינאז ו phosphatase יש ברובה הוגבלה סעיפים קטנים של מחזור התא 8,9,13,14.
כאן, אנו דנים בשיטה כדי לפקח על סריג מבוססי בדיקות הדמיה באמצעות ratiometric לאורך מחזור התא האנושי. השיטה מסתמכת על הציוד העומד לרשות חוקרים רבים במדעי החיים ואינו דורש ידע מומחה של מיקרוסקופיה או עיבוד תמונה.
Protocol
1. הצגת בדיקה לתאי Co-transfect תאים עם סריג בדיקה מבוססות לבין פלסמיד המקנה עמידות. בחר שיטת transfection כי הוא יעיל בסוג התא העניין שלך. עבור תאים U2OS, רמת סידן פוספט שיטות transfection לתת תוצאות נאות 15. <li style=";text-align:right;direction:rtl…
Discussion
ניטור סריג לאורך מחזור התא דורש השיקולים הם קריטיים פחות כאשר מעריכים לטווח קצר תגובות לגירויים חיצוניים. ראשית, התקדמות מחזור התא בקלות מוטרד איתות מתח, המחייב phototoxicity היא למינימום. שנית, כל הכתבים עלולה להשפיע על תהליכים תאיים על ידי titrating החוצה קינאזות, phosphatases או ת?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים נתמכים על ידי המועצה למחקר השוודי, הבסיס שוודית למחקר אסטרטגי, החברה השוודית סרטן, החברה השוודית סרטן ילדים, האייק Wibergs הקרן Jeanssons הקרן.
Hukasova, E., Silva Cascales, H., Kumar, S. R., Lindqvist, A. Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET. J. Vis. Exp. (59), e3410, doi:10.3791/3410 (2012).