从小份人血样本中单核细胞和树突状细胞谱系特异性Toll样受体介导信号通路的定量成像

摘要

我们介绍了ImageStream技术（www.amnis.com）的应用，该技术结合了定量流式细胞术与同步高分辨率数字成像，用于量化来自明确定义的患者队列的原代免疫细胞的细胞机制。我们的研究为转化研究提供了蓝图，可用于量化来自受试者队列小样本中谱系特异性的细胞反应。

摘要

免疫状态的个体差异决定了机体对感染的反应，并影响疾病的严重程度和结局。随着年龄增长，机体对病毒和细菌感染的易感性增加，对疫苗的应答能力下降，这与体液免疫和细胞介导免疫反应的显著衰退密切相关^1,2。我们近期研究了衰老对Toll样受体（TLRs）的影响，TLRs是先天免疫系统的关键组分，能够识别微生物感染并启动宿主抗微生物防御反应³。在一项针对大量健康人类供体的研究中，我们发现老年人外周血单核细胞中某些TLRs的表达和功能降低⁴，且树突状细胞（DCs）中也存在类似的TLR水平下降和信号转导反应减弱；树突状细胞作为抗原呈递细胞，在连接先天性免疫与适应性免疫中起关键作用⁵。我们还发现，老年供体来源的巨噬细胞中TLR3表达失调，其树突状细胞在西尼罗河病毒感染后产生干扰素（IFN）的能力降低^6,7。

深入了解免疫衰老以及进行治疗干预的关键在于，明确响应免疫刺激的特定细胞类型及其信号转导机制。传统的免疫反应研究主要依赖于对原代细胞的成像分析，以及通过流式细胞术（FACS）或免疫印迹法检测细胞标志物，这些方法极大地推动了该领域的进展。然而，这些技术通常受限于患者样本量较小，且难以在多个个体样本上同时开展复杂的实验操作。ImageStream 技术结合了定量流式细胞术与同步高分辨率数字成像，从而能够同时分析多个细胞群体，高效地捕捉患者的免疫易感性差异。本文中，我们展示了利用 ImageStream 技术在树突状细胞（DCs）中评估 TLR7/8 激活所诱导的关键转录因子 NF-κB 的磷酸化水平升高及其向细胞核的转位过程，该过程可启动多种对免疫应答至关重要的基因转录⁸。利用该技术，我们近期还发现老年供者单核细胞中 TLR5 信号通路及 NF-κB 通路存在此前未被识别的功能改变，这可能与衰老过程中免疫应答能力的改变有关⁹。

方案

1. 免疫细胞的分离与刺激

1. 根据当地机构审查委员会的指南，在获得健康志愿者书面知情同意后，采集 10–50 ml 肝素抗凝血。对于衰老或疾病发病机制的研究，必须明确界定每位志愿者或患者的纳入与排除标准。
2. 使用 CPT 管或 Ficoll-Paque Plus 分离人外周血单个核细胞（PBMCs），操作按照制造商说明进行（GE Healthcare, NJ），并在分离当天进行实验⁷（试剂，表 1）。
3. 将 PBMCs（每管 3 × 10⁶ 个细胞）置于 1.5 ml 管中，加入 0.6 ml 培养基单独孵育，或用 TLR 配体或其他激活剂刺激，例如 TLR7/8 配体 R848（0.6 ml 培养基加 0.6 μl 10 mM TLR7/8 配体 R848，终浓度为 10 μM），于 37 °C 孵育 10–60 分钟（InvivoGen, CA）⁹。

2. 细胞标记

1. 使用荧光标记的抗体对活细胞悬液中的细胞谱系及其他表面标志物进行标记。在1.5 ml离心管中，将3 × 10⁶个PBMCs与单核细胞或树突状细胞谱系特异性表面抗体混合物（表2）在100 μl PBS/2% FBS中、4 °C条件下孵育20分钟。最佳抗体稀释比例可通....

讨论

在使用ImageStream进行转化研究时，关键步骤包括选择相关的对照组，以及优化和验证抗体的特异性。通过直方图和细胞图像，可以清晰地观察到不同受试组之间标记靶标的差异。结合对相关受体和信号通路变化的深入分析，这些数据将为特定人群中免疫失调机制提供有价值的见解。该技术的局限性在于针对特定靶标、具有足够亲和力的特异性抗体的可获得性。此外，该仪器最适合多用户共享平台使用，且其分析软件需要一定时间才能熟练掌握。

该技术是人类疾病转化研究的一种强大手段。基因组测序和芯片技术的进步使得许多疾病相关变异得以被识别，但通常难以明确所涉及基因的作用机制。我们的研究为个体层面的转化研究提供了范例，例如刺激后NF-κB的核质分布比例分析。通过少量血液样本，即可在个体自身细胞中以谱系特异性的方式识别出差异性信号处理或信号传导。利用该方法，我们已对大量年轻与老年受试者的单核细胞进行了细胞反应的定量分析，并证实了衰老过程中细胞信号通路的改变⁹。ImageStream技术可更广泛地应用于多种研究场景，例如区分治疗应答者与非应答者的关键细胞机制，或用于个体在治疗前后的比较，以及疾病发作期与.......