A técnica amperométrica mede a libertação de dopamina a partir de uma única célula, detectando a corrente de oxidante produzido pela oxidação da dopamina espontânea. Braçadeira de tensão simultânea e metodologia amperometria revelar a relação mecanicista entre a "atividade" geral do transportador de dopamina eo papel regulador da atividade no transporte reverso da dopamina.
Depois de sua libertação para o sináptica de dopamina fissura, exerce suas propriedades biológicas através de suas metas pré-e pós-sináptica 1. O sinal de dopamina é terminada por difusão 2-3, enzimas extracelulares 4, e transportadores de membrana 5. O transportador de dopamina, localizado na fenda peri-sináptica dos neurônios dopaminérgicos limpa as aminas liberados através de um fluxo de dopamina para dentro (captação). O transportador de dopamina pode também funcionar no sentido inverso para libertar aminas a partir de dentro para fora, num processo denominado de transporte para o exterior ou o efluxo de dopamina 5. . Mais de 20 anos atrás Sulzer et al relataram o transportador de dopamina pode funcionar em dois modos de atividade: para frente (captação) e reverso (efluxo) 5. O neurotransmissor libertado através de efluxo através do transportador pode deslocar uma grande quantidade de dopamina para o espaço extracelular, e tem sido demonstrado que desempenham um papel importante na regulação da dopamina extracelular homeostasis 6. Aqui descreve-se como patch clamp e gravação simultânea amperometria pode ser usado para medir a dopamina libertada através do mecanismo de efluxo com resolução de milissegundos do tempo em que o potencial de membrana é controlado. Por isso, células inteiras actuais e oxidativa (amperométrico) sinais são medidos simultaneamente utilizando um amplificador Axopatch 200B (Molecular Devices, com um filtro passa-conjunto de filtros de Bessel de 1.000 Hz para gravação de células inteiras de corrente). Para a gravação de um amperometria eléctrodo de fibra de carbono está ligado a um segundo amplificador (Axopatch 200B), e é colocado adjacente à membrana de plasma e mantido a 700 mV. As células inteiras e oxidativa (amperométrico) as correntes podem ser registados e a relação de corrente-tensão pode ser gerado utilizando um protocolo de passo de tensão. Ao contrário da calibração habitual amperométrico, que requer a conversão de concentração, a corrente é relatado directamente sem ter em conta o volume de 7 eficaz. Assim, os dados resultantesrepresentar um limite inferior para o efluxo de dopamina porque alguns transmissor é perdido para a solução a granel.
Simultânea de tensão-clamp e amperometria tem os seguintes benefícios. Todos os tipos de células são acessíveis e podem ser utilizados para a gravação. A identificação das células neuronais ou onde as gravações são feitas é simples e directa. Em particular, se a célula é marcado por fluorescência por adição de um marcador fluorescente para a proteína de interesse, o experimentador pode facilmente seleccionar a célula alvo ou neuronal. A configuração experimental permite a distribuição uniforme …
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao Dr. Sanika Chirwa para revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (DA026947, DA021471, e NS071122).
Equipment | |||
Anti-vibration table w/faraday cage | Technical Manufacturing Corporation | 63-500 series | we use model 63-543 |
Inverted microscope Nikon TE-2000 | Nikon | discontinued | now Eclipse Ti |
Two low noise amplifiers axopatch 200b | Molecular Devices | 800-635-5577 | |
1-CV 203 BU headstage | Molecular Devices | 800-635-5578 | |
1-HL-U pipette holder | Molecular Devices | 800-635-5579 | |
Digidata 1440A A/D converter | Molecular Devices | 800-635-5580 | |
Two manipulators Siskyou, left and right handed | Siskiyou | MX6600R MX6600L | 877-313-6418 |
Laser pipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | 888-883-0128 |
Low noise carbon fiber amperometric electrode | ProCFE | www.dagan.com | |
Low noise quartz pipette | Sutter Instruments | QF100-70-7.5 | 888-883-0128 |
12-volt car battery | widely available | ||
Car battery charger | widely available | ||
Reagent | |||
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S7653 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Dextrose | Sigma | G7528 | |
Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma | P5655 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H20) | Sigma | 223506 | |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H20) | Sigma | M2670 | |
EGTA | Sigma | E0396 |