利用小鼠成肌祖细胞构建骨骼肌组织及电刺激的应用

摘要

工程化肌肉组织在再生医学、疾病模型以及作为肉类的替代来源方面具有巨大潜力。本文介绍了由小鼠成肌祖细胞构建肌肉组织的方法，并采用电脉冲对其进行刺激。

摘要

工程化肌肉组织可用于多种不同目的，包括作为疾病模型的组织制备 体外, 例如 用于研究压力性溃疡、再生医学以及作为肉类替代品 ¹最早的3D肌肉构建体早在多年前已有报道，该领域的先驱是Vandenburgh及其同事 ^2,3肌肉组织工程领域的进展不仅源于对生化因子、干细胞和前体细胞知识的极大丰富，更尤其基于研究人员所获得的深刻认识：物理因素在调控细胞行为和组织发育过程中发挥着至关重要的作用。目前最先进的工程化肌肉构建物通常由细胞接种的水凝胶结构组成。在我们的实验室中，这类构建物通常包含从小鼠后肢肌肉中分离的成肌前体细胞，或小鼠成肌细胞系C2C12，与胶原蛋白/Matrigel混合后，接种于两个固定锚点之间，以模拟肌肉韧带的结构。此外，也可考虑使用其他类型的细胞。 例如 替代性细胞系，例如 L6 大鼠成肌细胞 ⁴，新生儿肌肉来源的祖细胞 ⁵，来自其他物种（如人类）成年肌肉组织的细胞 ⁶ 或诱导性多能干细胞（iPS细胞） ⁷细胞收缩力导致细胞沿构建体的长轴方向排列 ^8,9 培养约一周后，肌肉前体细胞的分化情况。此外，施加电刺激可在一定程度上促进分化过程 ⁸由于其尺寸较小（8 x 2 x 0.5 mm），可利用共聚焦显微镜对整个组织进行分析，以监测 例如 活力、分化和细胞排列。根据具体应用，工程化肌肉组织的要求会有所不同； 例如 用于再生医学时，需要扩大组织规模并实现血管化，而作为肉类替代品则需将其技术转化应用于其他物种。

方案

1. 小鼠成肌祖细胞或C2C12细胞的培养

1. 根据 Shefer 及同事最初发表的方案分离细胞 ¹⁰ 随后由 Collins 改良 等 ¹¹ 和 Boonen 等 ¹² 并将其储存在液氮中。这需要小鼠， 例如 C57Bl/6。其他实验室采用不同的方法， 例如 李 Y 在《视觉化实验杂志》上发表的一种方法 等 ¹³有关试剂和设备，请参见第7页和第8页的表格。从一只小鼠的肌肉组织中通常可获得足够细胞，用于在液氮中冻存约20管。接下来，我们开始从液氮储存中复苏细胞的实验步骤。
2. 将1个小瓶中的细胞放入25 cm²培养瓶中² Matrigel（1 mg/ml）包被的组织培养瓶中加入生长培养基（GM），生长培养基由以下成分组成：335 ml DMEM 高级培养基、100 ml 胎牛血清（FBS）、50 ml HS、5 ml 青霉素/链霉素、5 ml L-谷氨酰胺、5 ml 鸡胚提取物（CEE）。

注意：在室温下包被 2 小时，然后通过抽吸去除 Matrigel。

3. 每3天将细胞以约1:3的比例进行传代培养。
   具体操作如下：第3天，将一个25 cm....

结果

最终产物将是如图3所示的肌肉构建物。组织的尺寸约为8 mm长、2 mm宽、0.5 mm厚。在分化过程中施加电刺激会改变肌球蛋白重链同工型的表达，但并不会显著增强由分化培养基所诱导的分化过程8；然而，可在培养过程结束时施加电刺激以检测肌肉的功能性，因为具有完全发育肌节的肌肉在受到电脉冲刺激时能够发生收缩。

还可通过定量 PCR 分析基因表达，以及通过染色检测肌肉成熟标志物或横纹发育情况，来评估分化与成熟过程（例如 对组织切片或整体染色的组织样本进行α-肌动蛋白（alpha actinin）染色。与肌肉成熟和分化相关的基因以及肌球蛋白重链的表达包括 例如 MyoD、myogenin、MFR4 和 MLP，以及 MYH 1、2、4 和 8 ⁸已有研究通过基因表达分析、免疫组织化学染色以及电刺激诱导收缩等方法，证实所形成的组织确为肌肉组织，并已发表于先前文献中。 ⁸ 以及本文中由成肌细胞前体细胞和C2C12细胞制备的肌肉组织染色横切面图显示于 图4

讨论

肌肉组织的工程化在疾病模型构建、药物筛选、再生医学以及肉类生产方面具有巨大潜力。然而，这些应用的具体需求各不相同。我们选择使用胶原蛋白与Matrigel的组合，因为胶原蛋白有助于细胞排列，且前期二维研究已证实，成肌祖细胞需要基底膜来源蛋白的存在。 ¹²此外，我们在实验室中测试了纤维蛋白凝胶，发现其对C2C12细胞和成肌祖细胞的支持作用不如胶原蛋白与Matrigel™混合物，尤其无法诱导组织收缩。 ¹⁴该模型如本文所述，已用于基于细胞系的压力性溃疡损伤研究。 ¹⁵在再生医学应用中，向人类卫星细胞的转化最近已实现 ^6,16此外，作为一种替代性的肉类消费来源，该技术具有巨大潜力 ¹然而，我们认为当前的技术需要进一步发展到下一阶段，以扩大其在临床应用和消费领域的使用。例如，目前的分化仅停留在新生儿阶段左右，且产生的力量远低于正常肌肉的收缩力 体内此外，尽管小鼠、大鼠和人类干细胞已可应用于三维结构中，但家畜来源的肌肉干细胞的分离，尤其是其分化与成熟，尚未发展到同等水平¹此外，必须避免使用Matrig.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
基质胶-生长因子减少型	Beckton and Dickinson
DMEM（高糖）*	Gibco	42430
高级DMEM	Gibco	12491
马血清	Gibco	65050-122
胎牛血清	Greiner	758075
0.45 和 0.22 μm 注射器滤器*	Whatmann (Schleicher and Scheull)	10462100
L-谷氨酰胺	Gibco	25030024
青霉素/链霉素	Gibco	10378016
两性霉素	Gibco	15290-018
细胞培养塑料器皿	Greiner		包括培养瓶和移液管
鸡胚提取物	United States Biological	C3999
巴斯德吸管*	Hilgenberg		带缩颈、带棉塞、敞口尖端的巴斯德吸管，长度：230 mm，尖端直径：0.9 - 1.1 mm
巴斯德吸管*	Hilgenberg		带缩颈、带棉塞、敞口尖端的巴斯德吸管，长度：230 mm，尖端直径：1.4 - 1.6 mm
巴斯德吸管	VWR	612-1702
I型胶原酶*	Sigma	C0130-16
40 μm 细胞筛	BD Falcon	352340
19G 针头
弹性体	Dow Corning corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210#
固化剂	Dow Corning corporation		Silastic MDX 4-4210#
魔术贴	普通商店		可在普通商店购买，仅使用柔软面
Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源	BD Biosciences	3544236
C-Pace EP 培养起搏器	Ionoptix
用于电刺激的6孔培养皿	Beckton Dickinson-Falcon	BD Falcon #353846
C-Dish 培养皿电极	Ionoptix
* 用于细胞分离（步骤1.1） # 包含在同一试剂盒中