在多孔板格式中快速高效地从人类多能干细胞生成神经元

摘要

多能性人类干细胞（hPSCs）的神经元分化方案通常耗时较长，且需要较高的细胞培养技术。本文中，我们改进了一种基于小分子的分化方法，将其应用于多孔板体系，从而能够以简单、快速且高效的方式在受控条件下生成人类神经元。

摘要

目前，由人类多能干细胞（hPSCs）生成神经元的现有方案通常较为繁琐，多为涉及神经前体细胞的分离与扩增、再进行终末分化的多步骤流程。与这些耗时的方法相比，我们近期发现，同时抑制三条信号通路——TGFβ/SMAD2、BMP/SMAD1 和 FGF/ERK——可促进 hPSCs 快速诱导为神经外胚层，随后立即分化为功能性神经元。在此，我们已将该方案优化为一种新型的多孔板格式，以进一步提高其可重复性，并使其适用于中通量应用。该流程包括在悬浮球体（类胚体）中进行四天的神经外胚层形成，随后在贴壁条件下继续分化四天形成神经元。采用本方案获得的大多数细胞表现为双极性感觉神经元。此外，该方法效率高，无需特殊的专业技能，且基于成分明确的简单化学培养基，辅以成本较低的小分子化合物。由于这些优势，该方案可作为进一步开展功能研究以及需要人类感觉神经元或各类神经元的细胞筛选方法的有用平台。

引言

人多能干细胞（hPSCs）包括来自胚胎的人胚胎干细胞（hESCs）和诱导性多能干细胞（hiPSCs），具有多能性，意味着它们在体外能够分化为多种细胞谱系in vitro ^1-2。迄今为止，已从hESCs成功获得多种分化的细胞类型，表明这些细胞是科学研究和基于细胞的筛选方法的重要工具，并在基于细胞的治疗方面展现出广阔前景。

人胚胎干细胞（hESCs）的神经元分化方案通常较为复杂且耗时，因为这些方案通常首先诱导整体神经命运，随后手动分离神经前体细胞，再进一步终末分化为特定的目标神经元类型^3-6。从某种程度上看，这种复杂性并不令人意外，也是不可避免的，因为目前先进的定向分化方案往往逐步模拟本身极为复杂的人类早期发育过程。另一方面，这种复杂性也可能部分反映了我们对潜在分子机制的理解尚不充分，导致现有的分化方案远未达到完全优化的状态。

关于未分化 hPSCs 转化为神经外胚层，Pera 等发现抑制BMP/SMAD1/5/8信号通路可增强hESCs的神经诱导⁷此外，SMAD2/3 信号通路的失活已被证明可促进神经外胚层的形成⁸因此，同时抑制这两条通路往往能够更高效地诱导人多能干细胞向神经细胞分化。^4,9最近，我们发现第三条信号通路 FGF/ERK 在 hESCs 神经外胚层承诺的最早阶段起....

方案

1. Matrigel 包被板和培养基的制备

1. Matrigel 包被板的制备：已发现 Matrigel 是促进分化中类胚体（EBs）贴附的优选基质，并能有效促进神经元从这些类胚体中向外生长¹⁰。
   1. 将 10 ml Matrigel 在冰上过夜解冻。
   2. 次日，用两倍体积的冰冻 DMEM/F-12 稀释呈凝胶状的 Matrigel，并在预冷的 15 ml 锥形管中分装成每管 1 ml，可于 -20 °C 冷冻保存。
   3. 确定用于神经元分化的培养板规格。例如，作为起始点，我们建议在 12 孔板中进行初步的分化实验。将四个 12 孔板预冷至 4 °C。通过加入 9 ml 预冷的 DMEM/F-12 并反复吹打，使一份冷冻的 Matrigel 完全溶解，直至所有预稀释的 Matrigel 均解冻并溶解均匀。
   4. 随后，将溶液转移至一个新的、装有 15 ml 冰上预冷 DMEM/F-12 的 50 ml 管中（最终 Matrigel 稀释比例为 1:75）。然后，向每个预冷的 12 孔板的孔中加入 0.5 ml 稀释后的 Matrigel。用封口膜包裹培养板，并在室温下静置过夜。
   5. 次日，将培养板转移至 4 °C。包被好的培养板可在使用前于 4 °C 保存数周。
2. 培养基....

结果

在我们先前的报道中，与其他许多研究一致，通过将人多能干细胞（hPSCs）常规传代时形成的细胞团块重新接种至低黏附培养皿中，即可简单地生成拟胚体（EBs）¹⁰。但这种方法通常会导致所生成的EBs尺寸分布较广（图1C，顶部）。由此引发的另一个问题是，悬浮培养的EBs倾向于相互聚集，从而进一步加剧了EBs尺寸的异质性。为克服这些问题，我们尝试将单个hPSCs接种至多孔板的低黏附孔中以生成EBs（图1A）。然而，该方法并未形成EBs，且导致细胞死亡（图1B，右下角）。添加已知可促进hPSCs存活的小分子Y-27632，结果仍相似。同样，添加先前报道可促进人胚胎干细胞（hESCs）形成EBs的聚乙烯醇（PVA）¹⁶，虽可使hPSCs在96V型孔板底部“聚集”，但仍未实现EBs的形成。然而，当联合使用Y-27632与PVA进行补充时，我们能够在化学成分明确的条件下，成功地从单细胞悬浮的hESCs中高效生成EBs（图1B）。此外，采用这种多孔板体系，可通过调节每孔接种的细胞.......

讨论

大多数涉及由hPSCs形成EB的分化方案（包括我们先前发表的方法¹⁰）均基于以细胞团形式手动或借助酶法收获hESC，这不可避免地导致EB大小的异质性。这一问题会引发某些细胞系分化效率的差异，从而难以进行系统性分析，尤其是在中等通量规模下。此外，手动解剖操作劳动强度大，其本身也限制了可扩展性。

相比之下，本文所述的方法基于单细胞形成拟胚体（EB），这有利于细胞操作，并最大限度地减少样品间的变异性。重要的是，我们发现，以旋转法形成的EB（spin EB）启动实验流程，并不会影响其向神经元分化的总体能力。此外，通过使用96孔悬浮培养板使各个EB彼此分离，可防止它们在悬浮状态下相互聚集——而这正是传统方法的另一项缺陷¹⁰。因此，启动特定实验所需的起始人多能干细胞（hPSCs）数量较少，通常一个6孔板中未达到完全汇合的hPSC克隆即可满足在两个96孔板中启动分化的需要。最后，旋转EB技术能够对EB的大小实现精确控制。根据我们的观察，贴壁后EB的神经元标志物表达水平在一定程度上随EB尺寸的增大而升高（图3A）。然而，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Matrigel HC	Becton Dickinson	354263	处理方法详见正文
DMEM/F-12	Life Technologies	21331-020
聚乙烯醇（Poly(vinyl alcohol)）	Sigma	363170	用超声水浴将其溶解于 DMEM/F-12 中，浓度为 0.4%，避免过热；可在 4 °C 保存数周
N2 添加剂	Life Technologies	17502-048	100X，分装后冻存
B27 添加剂	Life Technologies	12587-010	50X，分装后冻存
牛血清白蛋白	Sigma	A1595	10% = 500X，分装后冻存
含青霉素/链霉素的 L-谷氨酰胺	PAA	P11-013	或等效产品
FGF2	Peprotech	100-18B	用含 0.1% BSA 的 PBS 溶解至 10 μg/ml（即 1000X），分装后冻存
ROCK 抑制剂 Y-27632	abcamBiochemicals	Asc-129	用 DMSO 溶解至 10 mM（即 1000X），分装后冻存
PBS	PAA	H15-002	或等效产品
Accutase	PAA	L11-007
96 孔 V 型底板	Nunc	277143
PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408	用 DMSO 溶解至 0.5 mM（即 1000X），分装后冻存
SB431542	abcamBiochemicals	Asc-163	用 DMSO 溶解至 15 mM（即 1000X），分装后冻存
Dorsomorphin	Santa Cruz	sc-200689	用 DMSO 溶解至 0.5 mM（即 1000X），分装后冻存
96 孔 U 型底超低吸附板	Corning	7007
β-III 微管蛋白抗体（小鼠）	Sigma	T8660	使用稀释比为 1:1000
β-III 微管蛋白抗体（兔）	Covance	PRB-435P	使用稀释比为 1:2000
BRN3A (POU4F1) 抗体	Santa Cruz	sc-8429	使用稀释比为 1:500
表 1. 特异性试剂与设备。