在多孔板格式中快速高效地从人类多能干细胞生成神经元

摘要

多能性人类干细胞（hPSCs）的神经元分化方案通常耗时较长，且需要较高的细胞培养技术。本文中，我们改进了一种基于小分子的分化方法，将其应用于多孔板体系，从而能够以简单、快速且高效的方式在受控条件下生成人类神经元。

摘要

目前，由人类多能干细胞（hPSCs）生成神经元的现有方案通常较为繁琐，多为涉及神经前体细胞的分离与扩增、再进行终末分化的多步骤流程。与这些耗时的方法相比，我们近期发现，同时抑制三条信号通路——TGFβ/SMAD2、BMP/SMAD1 和 FGF/ERK——可促进 hPSCs 快速诱导为神经外胚层，随后立即分化为功能性神经元。在此，我们已将该方案优化为一种新型的多孔板格式，以进一步提高其可重复性，并使其适用于中通量应用。该流程包括在悬浮球体（类胚体）中进行四天的神经外胚层形成，随后在贴壁条件下继续分化四天形成神经元。采用本方案获得的大多数细胞表现为双极性感觉神经元。此外，该方法效率高，无需特殊的专业技能，且基于成分明确的简单化学培养基，辅以成本较低的小分子化合物。由于这些优势，该方案可作为进一步开展功能研究以及需要人类感觉神经元或各类神经元的细胞筛选方法的有用平台。

引言

人多能干细胞（hPSCs）包括来自胚胎的人胚胎干细胞（hESCs）和诱导性多能干细胞（hiPSCs），具有多能性，意味着它们在体外能够分化为多种细胞谱系in vitro ^1-2。迄今为止，已从hESCs成功获得多种分化的细胞类型，表明这些细胞是科学研究和基于细胞的筛选方法的重要工具，并在基于细胞的治疗方面展现出广阔前景。

人胚胎干细胞（hESCs）的神经元分化方案通常较为复杂且耗时，因为这些方案通常首先诱导整体神经命运，随后手动分离神经前体细胞，再进一步终末分化为特定的目标神经元类型^3-6。从某种程度上看，这种复杂性并不令人意外，也是不可避免的，因为目前先进的定向分化方案往往逐步模拟本身极为复杂的人类早期发育过程。另一方面，这种复杂性也可能部分反映了我们对潜在分子机制的理解尚不充分，导致现有的分化方案远未达到完全优化的状态。

关于未分化 hPSCs 转化为神经外胚层，Pera 等发现抑制BMP/SMAD1/5/8信号通路可增强hESCs的神经诱导⁷此外，SMAD2/3 信号通路的失活已被证明可促进神经外胚层的形成⁸因此，同时抑制这两条通路往往能够更高效地诱导人多能干细胞向神经细胞分化。^4,9最近，我们发现第三条信号通路 FGF/ERK 在 hESCs 神经外胚层承诺的最早阶段起着强烈的抑制作用。相反，同时抑制这三条信号通路可在短短四天内将 hESCs 几乎完全转化为神经外胚层¹⁰随后，在八天内观察到高效地终末分化为功能性神经元。所获得的神经元可能属于周围神经系统的感觉神经元，这在一定程度上解释了其快速衍生的原因。¹⁰感觉神经元维持功能缺陷被认为是家族性自主神经功能异常等某些人类疾病的原因¹¹基于hiPSC技术对这类疾病进行建模¹²对于进一步的功能表征，以及无需特定类型神经元的应用目的，该分化方案可提供一个有用的依据。

然而，我们最初采用的分化策略涉及从人胚胎干细胞（hESC）集落的细胞团形成胚胎体（EB）¹⁰，这种方法导致EB大小存在较大异质性，且在某些细胞系中似乎降低了神经元形成的效率。此外，由于EB大小的不均一性，在神经元形成过程中或之后系统性地检测其他生长因子或小分子作用的能力也受到一定干扰。

在本报告中，我们改进了先前的方法，采用一种适用于中等通量、基于强制聚集的技术，以高度可控的尺寸生成拟胚体（EB），该方法在其他研究背景下也已得到验证¹³。随后，将生成的EB从96孔板的V型孔转移至超低吸附性的U型96孔板中，使其在悬浮状态下启动神经外胚层的形成。四天后，可将EB接种培养，高效且均一地分化为终末神经元。 Alternatively，第4天的EB可被解离为单细胞后直接接种，从而形成低密度的人类神经元单层培养。目前，该方法已在两个独立来源的人胚胎干细胞系HuES6和NCL3中获得一致的结果。

作为前提条件，成功的拟胚体（EB）形成严格依赖于使用一种合成聚合物聚乙烯醇（PVA），以及已知可促进人胚胎干细胞（hESC）存活的ROCK抑制剂Y-27632^13-14。因此，与基于随机分割技术的大量培养方法相比，96-V-板中形成的拟胚体均一性显著提高。该系统 thus 为悬浮培养中的神经外胚层形成提供了显著改进的平台，随后可在贴壁条件下实现高度可控的神经元形成。

方案

1. Matrigel 包被板和培养基的制备

1. Matrigel 包被板的制备：已发现 Matrigel 是促进分化中类胚体（EBs）贴附的优选基质，并能有效促进神经元从这些类胚体中向外生长¹⁰。
   1. 将 10 ml Matrigel 在冰上过夜解冻。
   2. 次日，用两倍体积的冰冻 DMEM/F-12 稀释呈凝胶状的 Matrigel，并在预冷的 15 ml 锥形管中分装成每管 1 ml，可于 -20 °C 冷冻保存。
   3. 确定用于神经元分化的培养板规格。例如，作为起始点，我们建议在 12 孔板中进行初步的分化实验。将四个 12 孔板预冷至 4 °C。通过加入 9 ml 预冷的 DMEM/F-12 并反复吹打，使一份冷冻的 Matrigel 完全溶解，直至所有预稀释的 Matrigel 均解冻并溶解均匀。
   4. 随后，将溶液转移至一个新的、装有 15 ml 冰上预冷 DMEM/F-12 的 50 ml 管中（最终 Matrigel 稀释比例为 1:75）。然后，向每个预冷的 12 孔板的孔中加入 0.5 ml 稀释后的 Matrigel。用封口膜包裹培养板，并在室温下静置过夜。
   5. 次日，将培养板转移至 4 °C。包被好的培养板可在使用前于 4 °C 保存数周。
2. 培养基

EB 形成培养基（在一块 96 孔板中进行分化所需量约为 15 ml —见表 1 以及 图 2 中的示意图）：
DMEM/F-12 加 0.4% (PVA)
1× N2
1× B27
0.05% BSA
20 ng/ml FGF2
10 μM Y-27632
1× PenStrepGln

分化培养基（一个96孔板进行分化，随后在一个Matrigel包被的12孔板中形成神经元，约需30 ml，见表1）：
DMEM/F-12
1x N2
1x B27
0.05% BSA
0.5 μM PD0325901
15 μM SB431542
0.5 μM Dorsomorphin
1x PenStrepGln

2. 强制形成拟胚体

1. 在您偏好的无饲养层条件下培养人多能干细胞（hPSCs）。我们采用经MEF条件化处理的培养基，在Matrigel包被的6孔板中进行培养¹⁵。然而，其他培养系统，如自制或商用的化学成分明确培养基，也应可行。开始诱导分化实验时，hPSCs应处于亚融合状态，并处于活跃生长阶段。
2. 在体视显微镜下，使用无菌塑料移液枪头机械去除自发分化的克隆。
3. 用PBS洗涤剩余的未分化克隆，加入含1× Y-27632的Accutase消化为单细胞。在200 × g条件下离心2分钟使单细胞沉淀，用少量拟胚体（EB）形成培养基重悬，并使用血细胞计数板测定细胞浓度。
4. 将一定量的细胞加入剩余的EB形成培养基中，使终浓度达到每毫升40,000至80,000个细胞。
5. 使用多通道移液器将100 μl细胞悬液转移至96V底板的每个孔中，使每孔含有4,000至8,000个细胞。将96孔板置于摆动式平板离心机中，在400 × g条件下离心1分钟，使细胞沉降至孔底，随后转移至细胞培养孵箱中。拟胚体将在过夜培养后形成，如图1所示。

3. 神经外胚层诱导

1. 次日（第0天），在体视显微镜下从96V孔板中收集胚胎体（EBs），转移至含有2 ml分化培养基的3.5 cm细菌培养皿中，体积尽量小。轻轻振荡培养皿数秒，以洗涤EBs。
2. 向超低吸附U型底96孔板的每孔中加入100 μl分化培养基。在体视显微镜下，将洗涤皿中的EBs以小体积逐个转移至96U孔板中（每孔一个EB）。将96U孔板放入细胞培养箱中培养4天，以促进神经外胚层形成。

4. 神经元形成

1. 第4天，按步骤3.1准备一个洗涤皿，并在预热的Matrigel包被的12孔板中，用分化培养基替换DMEM/F-12培养基（每孔1 ml）。
2. 胚状体（EB）接种
   1. 从96U板中收集EB，按上述方法洗涤，然后将EB逐个小心接种至Matrigel包被的12孔板中（每孔约8个EB）：EB应在孔内均匀分布，以便在接下来的几天中神经元能够不受干扰地向外生长（参见图2中的“第5天”图像）。
   2. 在将12孔板放回培养箱前，于室温下静置约10分钟，使EB初步松散贴附。随后，小心将12孔板转移至细胞培养箱中。在接下来的4天内，神经元将从接种的EB呈放射状向外生长，如图2所示（右侧“第8天”图像）。

5. 以单层形式形成神经元

1. 作为第4步的替代方案，在操作的第4天，将EBs收集到含有2 ml分化培养基的3.5 cm细菌培养皿中，然后将EBs以少量体积转移至含PBS的培养皿，再转入另一含有Accutase的培养皿中。
2. 消化至单细胞，以200 × g离心2分钟，用少量分化培养基重悬，并使用血细胞计数板测定细胞滴度。用分化培养基（不含Y-27632）将滴度调整至每毫升1–2×10⁶个细胞。
3. 将细胞接种于预温的Matrigel包被的12孔板中（每孔1 ml），并转移至细胞培养孵育箱。在第7至第8天可观察到以单层形式形成的神经元（图3C）。但需注意，该操作的单层培养变体在细胞存活率和最适基质方面尚未完全优化。

结果

在我们先前的报道中，与其他许多研究一致，通过将人多能干细胞（hPSCs）常规传代时形成的细胞团块重新接种至低黏附培养皿中，即可简单地生成拟胚体（EBs）¹⁰。但这种方法通常会导致所生成的EBs尺寸分布较广（图1C，顶部）。由此引发的另一个问题是，悬浮培养的EBs倾向于相互聚集，从而进一步加剧了EBs尺寸的异质性。为克服这些问题，我们尝试将单个hPSCs接种至多孔板的低黏附孔中以生成EBs（图1A）。然而，该方法并未形成EBs，且导致细胞死亡（图1B，右下角）。添加已知可促进hPSCs存活的小分子Y-27632，结果仍相似。同样，添加先前报道可促进人胚胎干细胞（hESCs）形成EBs的聚乙烯醇（PVA）¹⁶，虽可使hPSCs在96V型孔板底部“聚集”，但仍未实现EBs的形成。然而，当联合使用Y-27632与PVA进行补充时，我们能够在化学成分明确的条件下，成功地从单细胞悬浮的hESCs中高效生成EBs（图1B）。此外，采用这种多孔板体系，可通过调节每孔接种的细胞...

讨论

大多数涉及由hPSCs形成EB的分化方案（包括我们先前发表的方法¹⁰）均基于以细胞团形式手动或借助酶法收获hESC，这不可避免地导致EB大小的异质性。这一问题会引发某些细胞系分化效率的差异，从而难以进行系统性分析，尤其是在中等通量规模下。此外，手动解剖操作劳动强度大，其本身也限制了可扩展性。

相比之下，本文所述的方法基于单细胞形成拟胚体（EB），这有利于细胞操作，并最大限度地减少样品间的变异性。重要的是，我们发现，以旋转法形成的EB（spin EB）启动实验流程，并不会影响其向神经元分化的总体能力。此外，通过使用96孔悬浮培养板使各个EB彼此分离，可防止它们在悬浮状态下相互聚集——而这正是传统方法的另一项缺陷¹⁰。因此，启动特定实验所需的起始人多能干细胞（hPSCs）数量较少，通常一个6孔板中未达到完全汇合的hPSC克隆即可满足在两个96孔板中启动分化的需要。最后，旋转EB技术能够对EB的大小实现精确控制。根据我们的观察，贴壁后EB的神经元标志物表达水平在一定程度上随EB尺寸的增大而升高（图3A）。然而，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Matrigel HC	Becton Dickinson	354263	处理方法详见正文
DMEM/F-12	Life Technologies	21331-020
聚乙烯醇（Poly(vinyl alcohol)）	Sigma	363170	用超声水浴将其溶解于 DMEM/F-12 中，浓度为 0.4%，避免过热；可在 4 °C 保存数周
N2 添加剂	Life Technologies	17502-048	100X，分装后冻存
B27 添加剂	Life Technologies	12587-010	50X，分装后冻存
牛血清白蛋白	Sigma	A1595	10% = 500X，分装后冻存
含青霉素/链霉素的 L-谷氨酰胺	PAA	P11-013	或等效产品
FGF2	Peprotech	100-18B	用含 0.1% BSA 的 PBS 溶解至 10 μg/ml（即 1000X），分装后冻存
ROCK 抑制剂 Y-27632	abcamBiochemicals	Asc-129	用 DMSO 溶解至 10 mM（即 1000X），分装后冻存
PBS	PAA	H15-002	或等效产品
Accutase	PAA	L11-007
96 孔 V 型底板	Nunc	277143
PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408	用 DMSO 溶解至 0.5 mM（即 1000X），分装后冻存
SB431542	abcamBiochemicals	Asc-163	用 DMSO 溶解至 15 mM（即 1000X），分装后冻存
Dorsomorphin	Santa Cruz	sc-200689	用 DMSO 溶解至 0.5 mM（即 1000X），分装后冻存
96 孔 U 型底超低吸附板	Corning	7007
β-III 微管蛋白抗体（小鼠）	Sigma	T8660	使用稀释比为 1:1000
β-III 微管蛋白抗体（兔）	Covance	PRB-435P	使用稀释比为 1:2000
BRN3A (POU4F1) 抗体	Santa Cruz	sc-8429	使用稀释比为 1:500
表 1. 特异性试剂与设备。