T细胞的定量高通量单细胞细胞毒性检测方法

摘要

我们描述了一种高通量单细胞检测方法，用于测量T细胞与肿瘤靶细胞共孵育时的细胞毒性。该方法采用高密度的弹性体微孔阵列（每个阵列约10万个亚纳升级微孔），将T细胞与靶细胞以特定比例在空间上进行限定，并结合荧光显微镜技术，实时监测效应细胞与靶细胞的结合以及后续的细胞凋亡过程。

摘要

癌症免疫治疗可以利用免疫反应的特异性来靶向并清除肿瘤。基于过继性转移经基因改造以表达嵌合抗原受体（CAR）的T细胞的过继性细胞治疗（ACT），在临床试验中已显示出巨大前景^1-4。使用CAR⁺ T细胞治疗癌症具有多项优势，包括能够靶向非MHC限制性抗原，对T细胞进行功能优化以实现在宿主体内的最佳存活、归巢和持久性；最后，当出现宿主毒性时，可诱导CAR⁺ T细胞发生凋亡⁵。

明确CAR的最佳功能⁺ 与临床获益相关的T细胞对于设计下一代临床试验至关重要。活体动物成像技术（如多光子显微镜）的最新进展已彻底改变了免疫细胞功能的研究。 体内^6,7尽管这些研究推动了我们对T细胞功能的理解 体内基于T细胞的过继性细胞治疗（ACT）在临床试验中，需要通过利用输注前T细胞制剂的分子与功能特征，将其与输注后的临床疗效相关联 体外 检测T细胞功能（如细胞毒性和细胞因子分泌）的实验方法。目前已开发出基于标准流式细胞术的检测方法，可在单细胞水平上测定T细胞群体的整体功能，但这些方法不适用于监测免疫突触的形成与持续时间，或同一细胞杀伤多个靶细胞的能力。⁸.

采用生物相容性聚合物（如聚二甲基硅氧烷（PDMS））制备的微加工阵列，是一种在微小体积内对效应细胞与靶细胞进行空间限制的极具吸引力的方法⁹。结合自动化的延时荧光显微镜技术，可通过成像纳米孔阵列中的各个独立孔，同时监测数千个效应细胞-靶细胞相互作用。本文介绍一种高通量的方法，用于在单细胞水平上监测T细胞介导的细胞毒性，该方法可广泛应用于研究T细胞的溶细胞功能。

方案

1. 试剂准备

1. 通过将500 ml RPMI-1640与各5 ml的青霉素-链霉素、L-谷氨酰胺和HEPES溶液混合，制备RPMI-PLGH。
2. 通过将RPMI-PLGH与10%胎牛血清（FBS）混合制备R10溶液。FBS在添加前需在56 °C下热灭活30分钟。
3. 将50 ml RPMI-PLGH、15 ml PBS和15 ml R10在无菌锥形管中于37 °C预热。
4. PDMS中纳米孔阵列的制备：硅模板的制备采用光刻技术，基本步骤如先前所述¹⁰。在一次性杯子中使用塑料刀以10:1的质量比充分混合Sylgard 184弹性体试剂盒的基础剂和固化剂。将混合物置于真空腔中脱气1小时。将混合物倒入纳米孔阵列上，用载玻片密封并静置30分钟。将组装件转移至设定为80 °C的烘箱中加热2小时，然后在室温下冷却1小时。在此期间，弹性体会固化并与载玻片粘合。含有PDMS纳米孔阵列的载玻片从硅模板上小心剥离，用透明胶带覆盖后保存，以备后续使用。

2. 靶细胞（T）标记

1. 使用血细胞计数板计数500万个靶细胞，并在无菌15 ml锥形管中以340 × g离心5分钟收集细胞。前一天将细胞培养物以总体积5 ml（密度=100万个/ml）分装至T-25培养瓶（VWR）中进行培养。使用血细胞计数板进行细胞计数的实验方案此前已有详细描述¹¹。
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结果

高通量细胞溶解实验的应用示例如图2所示。简言之，将标记的CD19特异性CAR⁺ T细胞与标记的小鼠EL4靶细胞共同孵育于纳米孔阵列的各个孔中（第1-5节）。在自动荧光显微镜下采集初始图像，以确定阵列中每个纳米孔的占据情况（效应细胞和/或靶细胞）（第6节）。通过图像处理识别出恰好含有一个靶细胞和一个效应细胞的纳米孔，并排除含有死亡靶细胞的纳米孔（第9节）。将芯片转移至培养箱中孵育6小时，随后对芯片进行第二次成像（第7-8节）。通过Annexin V染色检测恰好含有一个效应细胞和一个靶细胞的纳米孔中效应细胞诱导靶细胞凋亡的能力。使用相同的效应细胞和两组不同的靶细胞（EL4-CD19⁺ 和 EL4-CD19-（阴性对照））平行进行两次实验，以确定抗原特异性裂解的频率（图2）。理想的非特异性裂解频率应较低（约2-4%）。该方法依赖于合适靶细胞的可获得性，需平行开展实验以评估无效应细胞存在时靶细胞的自发凋亡情况。若在6小时孵育期间，无效应细胞存在时靶细胞凋亡频率较高（> 8%），则需优化培养及实验条件。当需要连续监测时，纳米孔阵列可适用.......

讨论

我们已概述了一种高通量单细胞细胞毒活性检测方法的实验方案，该方法通过将效应细胞与靶细胞共同孵育于纳米孔阵列中实现（图1）。除高通量外，该技术的主要优势在于能够监测效应细胞对特定靶细胞的细胞毒性作用，而无需对靶细胞进行基因工程改造，从而允许使用自体来源或配对的原代肿瘤细胞作为靶细胞。空间限域特性使得在实验结束时可回收并进一步克隆具有功能活性的T细胞⁹。该检测方法的一个局限性在于需要配备自动载物台和快速切换光学系统的专业显微镜。然而，鉴于此类设备目前已广泛作为科研核心设施的组成部分，这一限制并不严重。

基于流式细胞术的多种检测方法可在保持单细胞分辨率的同时实现更高的通量。这些方法包括针对脱颗粒替代标志物（CD107a）、效应细胞中的穿孔素含量以及靶细胞中caspase/颗粒酶活性的染色检测 ^13,14 然而，这些检测方法并不能真正监测效应细胞与靶细胞的结合，或效应细胞识别并杀伤多个靶细胞的能力。与经典的4小时51Cr释放实验（通常在效靶比为1:1的条件下进行）相比，我们的方法通常能够报告总体相当数量的细胞溶解.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI-1640 不含 L-谷氨酰胺	Cellgro	15-040-CV
青霉素-链霉素	Cellgro	30-002-CI	10,000 I.U. 青霉素，10,000 μg/ml 链霉素
L-谷氨酰胺	Cellgro	25-005-CI	200 mM 溶液
HEPES	Sigma Aldrich	H3537	1 M
胎牛血清（FBS）	Atlanta Biologicals	S11150	经批次检测
Cell Tracker Red 染料	Invitrogen	C34552	50 μg
Vybrant DyeCycle Violet 染料	Invitrogen	V35003	5 mM
SYTOX Green 核酸染料	Invitrogen	S7020	5 mM
Annexin V-Alexa Fluor 647	Invitrogen	A23204	500 μl
Dulbecco's PBS	Cellgro	21-031-CV	500 ml
Noble 琼脂	DIFCO	2M220	100 g
台盼蓝	Sigma Aldrich	T8154	0.4% 液体，经无菌过滤
血细胞计数板	Hausser Scientifics	1492	亮线型
4 孔板	Thermo Fisher	167603
Harrick 等离子清洗仪	Harrick Plasma	PDC-32G	基础型等离子清洗仪
Observer.Z1	ZEISS		荧光显微镜（与以下三个部件配合使用）
Lambda 10-3	Sutter Instrument		滤光片控制器
Lambda DG-4	Sutter Instrument		超高速波长切换器
Hamamatsu EM-CCD 相机	Hamamatsu	C9100-13	CCD 显微成像相机
15 ml 圆锥形离心管	BD Falcon	352097
50 ml 圆锥形离心管	VWR	3282-345-300
Nikon Biostation	Nikon Instruments Inc.	Biostation IM
玻璃底培养皿	MatTek Corporation	P35G-0	35 mm 培养皿，10 mm 微孔