生产二硫键稳定的跨膜肽复合物的结构研究

Summary

膜嵌入蛋白结构域之间的相互作用的生物物理和生物化学的研究面临许多技术上的挑战，首先是获得适当的学习材料。本文描述了一种用于生产和纯化二硫键稳定的的跨膜肽复合物，是适合用于结构分析通过溶液的核磁共振（NMR）和其他的分析应用的协议。

Abstract

脂质嵌入的膜蛋白，α-螺旋结构域之间的物理相互作用起着至关重要的作用，在膜蛋白复合体的折叠和装配和跨膜（TM）信令和细胞表面蛋白水平的调节，例如动态过程。了解这些关联的特定序列的结构特点，需要复杂的生物物理和生物化学分析TM肽复合物。然而，TM域的极端疏水性使得它们非常难以操纵使用标准的肽化学技术，生产合适的学习材料常常被证明是令人望而却步具有挑战性的。确定的条件下，肽可以采用稳定的螺旋构象，并形成复合物， 自发地增加了更深一层的难度。在这里，我们提出了一种程序，均聚物或杂二聚体TM肽复合物，从材料的生产是在大肠杆菌中表达的关口，从而允许稳定同位素标签用于核磁共振（NMR）或其他应用程序相对廉价的非天然存在的氨基酸的掺入。在此方法中的关键的创新是作为共价结合 （二硫键交联的）组件改组为洗涤剂，脂质或其他膜-模拟物时，可以形成稳定的，化学计量的和均质的结构，TM配合物的生产和纯化。我们还提出了精心优化的程序也同样适用，无论是生产单TM域或交联复合物的表达和纯化，并提供这些方法来适应新的TM序列的意见。

Introduction

该协议的细节一个过程中，我们已开发生产出二硫键稳定的复合物的跨膜肽（TM）采用溶液NMR结构研究。这个过程需要利用所提供的强大的表达ΔtrpLE1413融合系统（见下文），并允许使用先进的稳定同位素标记技术，现代化的多维NMR实验TM肽复合物的定义组成。我们采用这些技术来确定的NMR结构淋巴细胞活化免疫受体如何从多个膜蛋白亚基组装TM域之间的相互作用^（1）最近检讨发现重要的新信息。这些技术适用于许多其他的膜蛋白的系统，以及广泛的下游除了溶液的NMR分析方法。虽然这里给出的例子利用本地的半胱氨酸残基创建一个复杂的，模仿自然的二硫键键合的蛋白，设计是同样适合于创建工程二硫键稳定的复合物，通常是由较弱，均聚物和杂二聚体TM配合物的非共价相互作用，如保持在一起表皮生长因子受体（EGFR）家族蛋白^2-4或异源二聚体αβ整合复合物^5,6。

非常疏水的肽序列，如那些来自脂质双层跨越TM蛋白的部分是极为困难的课题，生物化学和生物物理研究。除了是非常具有挑战性的操作使用标准的蛋白质和多肽化学技术，他们往往对细胞的毒性，因此难以产生重组。我们^7,8和^9-11有显着的成功表达这样的困难在细菌的肽序列帧中的羧基端来自大肠杆菌的修改版本的ΔtrpLE1413序列融合到大肠杆菌色氨酸操纵^12。 〜13 ....

Protocol

1。克隆的结构和设计

感兴趣的序列克隆到PMM-肽用HindIII和BamHI限制性位点（参见图1）的载体（可以按要求提供）。按以下顺序:一个HindⅢ位点的双链DNA，插入应纳入CNBr裂解; E 的一个单一的蛋氨酸密码子大肠杆菌密码子优化的编码序列的肽，一个终止密码子，一个BamHⅠ位点。应消除所有其他的肽中的蛋氨酸和二肽序列天冬 - 亲应避免，因为它也可以在酸性条件下裂解。

一个独特的半胱氨酸残基应被引入每个肽序列，根据所需的定位，在最终的复合物的二硫化物交联，和所有其他半胱氨酸应突变为丝氨酸。该质粒携带用于选择卡那霉素抗性盒。

2。表达trpLE-pepti的去融合

1. 化妆和无菌过滤器M9/Kan最小的生长培养基中（0.1毫的CaCl _2，2mM的用MgSO _4，3克/升KH ₂ PO _4，7.5克/升的Na ₂ HPO _{4·2H 2} O，0.5克/升的NaCl， 1克/升NH _{4 Cl的} ，4的g / L葡萄糖，50mg / L的硫酸卡那霉素）。补充中枢完成A提供B族维生素和微量金属元素:1片溶解在40毫升H _2....

Results

trpLE融合实现的表达水平是可变的和严重依赖于连接的肽的氨基酸序列， 图3示出了预诱导的SDS-PAGE分析（泳道1）和时间的收获（泳道2）从文化，取得了约120毫克的纯的，完整trpLE DAP12TM融合从1升的文化和4毫升镍基样品。所有的trpLE DAP12TM融合的定位包涵体的沉淀（泳道4），而不是为上清液（泳道3）。

约70％的镍-纯化trpLE DAP12TM融合是二硫键交联的二聚体形式（ 图3，泳道5和6:非还原和还原样品的TFA洗脱液）。这是一个典型的结果为trpLE DAP12TM融合，但交联效率将随工程半胱氨酸安置。 DAP12TM肽产品是不容易识别的总的CNBr消化样品（泳道7和8）中，但减少消化样品中的完整的融合和trpLE片段带（泳道8）的比较表明，消化的融合的时间是，已完成60％。

图4示出了用反相HPLC分离的摘要产品使用制备规模C3列（总结合容量〜200毫克的蛋白质）。由于融合的芳烃含量.......

Discussion

根据我们的经验， 表达的融合trpLE-TM。trpLE-TM融合低表达丰富的培养基中在37℃下，和这里所描述的培养条件为许多不同的序列，含有一至四个TM域，产率范围已证明是成功的为50〜150 mg / L的纯的，完整的融合。融合编码三-或四-TM G蛋白偶联受体片段（人CCR5 TM1-TM3和TM4-TM7分别）或人类信号肽肽酶（4 TM域;见文献^15）的芯催化片段代表在此范围内的最低的表达的水平，而这里所使用的序列表示的范围内的最高端（未发表的数据）密切相关的DAP12TM变种。最佳IPTG浓度应通过实验来确定对于每一个新的序列。我们的标准是0.1毫米，和更高的浓度（高达1毫摩尔），通常会导致产率显着降低，由于两个较低的表达水平和下培养密度吨收获（见参考文献⁷中例如图1A）。

变化对所提出的协议，该协议概述这里描述二硫键交联的TM肽复合物^，8 DAP12TM同型二聚体的生产。可替换地，协议是很容易适合于产生通过省略的两个设计的洗涤步骤以除.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂/材料名称	公司	目录编号	评论
溴化氰	ALDRICH	P.No，CAS-506-C91492-68-3	有害物质。危险品。非常吸入毒性，与皮肤接触和吞食。与酸接触会产生剧毒气体。对水生生物有剧毒，可能对水生环境造成长期的不良影响。
三氟乙酸	SIGMA-ALDRICH	P.CODE 1000984387，CAS编号76-05-1	有害物质。危险品，造成严重灼伤。吸入有害。对水生生物有害，可能对水生环境造成长期的不良影响。
2 - 巯基乙醇	SIGMA-ALDRICH	P.No M7154，CAS编号60-24-2	有害物质。危险品 。吸入，皮肤接触及若食入。对皮肤有刺激性。严重伤害眼睛的危险。皮肤接触可能引起过敏。对水生生物有剧毒，可能对水生环境造成长期的不良影响。
1,1,1,3,3,3 - 六氟-2 - 丙醇	SIGMA-ALDRICH	产品编号52512，CAS编号。 920-66-1	有害物质。危险品 。吸入有害，如果吞食。引致灼伤。
蚁酸	默克	K41186564	易燃液体和蒸气。造成严重皮肤灼伤和眼损伤。
尿素	UNIVAR，AJAX FINECHEM	产品型号，817，CAS编号57-13-6	当加热时，十二月omposes二氧化碳和氨;如果烧掉，发出少量的氮氧化物。会导致红肿和刺激皮肤和眼睛。
盐酸胍	AMRESCO	P.No-M110，CAS号码:50-01-1	如果吞下将是有害的，造成严重眼刺激，使皮肤有刺激性，急性口服毒性，皮肤刺激性，对眼睛有刺激性。
TRITON X-100	SIGMA	产品编号T8532 CAS编号:9002-93-1	的Triton X-100是一种非离子洗涤剂，100％活性成分，通常被用在以溶解蛋白质的生化应用。的Triton X-100具有无抗菌性能，并考虑了相对温和的非变性洗涤剂
他选择镍亲和凝胶	SIGMA-ALDRICH	产品目录号P6611	IS-选择镍亲和凝胶是一种固定化金属离子亲和层析（IMAC）产品。他的选择尼克EL亲和凝胶是一种专有的四齿螯合，组氨酸含有蛋白质的特异性结合，目的是用镍珠状琼脂糖收取。
（ - ） - 谷胱甘肽，氧化	SIGMA-ALDRICH	目录NUM 150568
Misonix S-3000超声波仪	QSONICA	S-3000（已停产）	最大功率输出600瓦。 2英寸可更换的尖探针采用2英寸的高强度，高容量的提示和一系列的高强度，低容量的提示。最近的机型，目前该公司的Q500和Q700。
RP-HPLC:生物DuoFlow层析系统，软件5.3版	Bio-Rad公司实验室	目录编号760-0047，配置编号:AU500571，序列号:484BR3705	肽结合反相HPLC色谱柱在高AQueous流动相，洗脱RP HPLC柱高有机流动相。在反相高效液相色谱法分离的肽根据其疏水性。肽可通过运行的有机溶剂的线性梯度分离。
准备HT C3 ZORBAX 300SB分析HPLC柱，21.2×150毫米，5微米的颗粒大小	安捷伦	产品编号:895150-909	反相HPLC柱
的NuPAGE 12％的Bis-Tris凝胶	Life Technologies公司	NP0341BOX	前投凝胶蛋白电泳
幻灯片-A仪G2透析的带3.5K MWCO	Thermo Scientific的	产品编号:87724	样品透析