Реализация динамического Хомут с Synaptic и искусственного проводимости в мыши ганглиозных клеток сетчатки
Summary
Это видео иллюстрирует статью настройки, процедуры, чтобы исправить клеточных тел и, как реализовать динамические записи зажим из ганглиозных клеток в целом монтажа сетчатки мыши. Этот метод позволяет исследовать точное вклад возбуждающих и тормозных синаптических входов, и их относительная величина и сроки нейронов пики.
Abstract
Ганглий клетки являются выходными нейронами сетчатки и их деятельность отражает интеграцию различных синаптических входов, вытекающих из конкретных нейронных цепей. Патч зажим методы, в напряжении зажим и зажим текущих конфигураций, которые обычно используются для изучения физиологических свойств нейронов и характеризуют их синаптических входов. Хотя применение этих методов является весьма информативным, они представляют различные ограничения. Например, трудно количественно как точное взаимодействие возбуждающих и тормозящих входов определения выходного отклика. Для решения этого вопроса мы использовали модифицированную технику текущего зажим, зажим динамической, которая также называется проводимостью 1 зажим, 2, 3 и изучили влияние возбуждающих и тормозных синаптических входов на возбудимость нейронов. Этот метод требует введения ток в клетку и зависит от реального времени обратной связи ее мембранный потенциал в то время. Или введенныхD Текущее рассчитывается по заданной возбуждающих и тормозных синаптических проводимостей, их потенциалы разворот и мгновенная мембранного потенциала клетки. Подробности на экспериментальные процедуры, фиксации потенциала клетки для достижения цельноклеточная конфигурации и занятости метод динамического зажим показано на этом видео статье. Здесь показана реакции мыши ганглиозных клеток сетчатки к различным проводимость сигналов, полученных из физиологических экспериментов в контрольных условиях или в присутствии препаратов. Кроме того, мы покажем использование искусственных возбуждающих и тормозящих проводимость генерируется с использованием альфа-функции для исследования реакции клеток.
Introduction
Сетчатка почти прозрачной нервной ткани, выстилающие задней части глаза. Многие исследования сетчатки использовать как модель для изучения первых шагов в обработке зрительной и механизмы синаптической сигнализации. Поскольку сетчатки сети в целом монтажа препарат остается неизменным после вскрытия, он представляет собой идеальную системы для изучения синаптических взаимодействий как его физиологические реакции очень похожи в естественных условиях. Таким образом, в изолированной сетчатки свойства его нейроны могут быть исследованы с помощью методов патч зажим (по отзывам на технике, см. 6,9,13). Идентификация точной вклада отдельных схем и нейротрансмиттеров ганглий-клеточный ответ, однако, как правило, препятствуют в качестве фармакологических агентов выступают на различных участках.
Физиологические реакции нейронов сетчатки к свету, натуральный раздражитель, могут быть записаны со стеклянной пипетки заполнены внутриклеточной жидкости. Использование патча CLусилитель методы, нейронные ответы на световое раздражение может быть записана как колебания мембранного потенциала (токовые клещи) или в виде токов (напряжения зажим). Путем проведения мембранного потенциала при различных напряжениях и реализации апостериорного анализа проводимости, можно изолировать тормозных и возбуждающих синаптических входов 5,12. Этот тип эксперименты можно проводить в нормальной среде купание и в присутствии различных фармакологических агентов, чтобы изолировать вклад различных нейротрансмиттеров и рецепторов нейронов ответов. Множество исследований из многих лабораторий характеризуется зависимость пики производства и возбуждающих и тормозных входов на стимул свойства, такие как размер, контрастность, пространственных и временных частот, направление ориентации и другие переменные стимула. Хотя эти экспериментальные подходы предоставить информацию об отношениях между всплеск производства и синаптические входы в зависимости от свойств стимула,Интерпретация вклада специфических типов клеток и их синаптических входов возбудимости клеток не совсем просто. Это связано с тем, что обычно возбуждающие и подавляющие входов зависит стимул свойства и, таким образом, это не возможно оценить точное влияние, что изменения в любом из этих входов имеет на нейронную пики.
Альтернативный подход, чтобы обойти эти ограничения, осуществлять динамическое зажим записи, которые позволяют критически оценить вклад отдельных синаптических входов пики выхода. Динамический метод зажима обеспечивает прямое впрыскивание текущего в камеру и количество ток, подаваемый в данный момент времени, зависит от записанных мембранного потенциала в то время 1,2,3 (для обзора см. 7,14). Это изменение текущей зажим настройки, где в режиме реального времени, быстрое взаимодействие обратной связи между клеткой при записи и устройство, содержащее специализированные аппаратные средства, программное обеспечениеи компьютер достигнута. Величина тока, введенный в клетку вычисляется соответственно. Таким образом, преимуществом этого метода является то, что клетки могут быть стимулированы с различными комбинациями проводимость сигналов, и его ответ будет имитировать активации рецепторов, которые опосредуют синаптических входов. Например, сравнение ответ на инъекцию возбуждающих и тормозящих проводимость для небольшого места с ответом на инъекцию возбуждающих проводимости для небольшого места только предоставляет информацию о влиянии ингибирование клеточного ответа. Аналогичным образом, другие комбинации физиологически записаны проводимостей могут быть совместно вводили чтобы показать, как стимул-зависимые изменения в возбуждающих и / или ингибирующим проводимость влияют шип выход.
В нашем исследовании, метод динамического зажим используется для демонстрации влияния относительной амплитуды и времени синаптических входов на огневом свойства ганглиозных клеток сетчатки. Различные проводимостиполученные из физиологической экспериментов в контрольных условиях или в присутствии фармакологических агентов были использованы в качестве входных данных. Кроме того, искусственное проводимости на основе альфа-функции также были использованы для того, чтобы исследовать, как синаптические входы интегрируются нейронов. Таким образом, это универсальный метод, который позволяет различные типы проводимости генерироваться как физиологически, фармакологически или вычислительно, который будет введен в ту же клетку ганглия, так что сравнение ответов на эти входы могут быть сделаны.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь показано использование динамического зажим, чтобы оценить влияние соотношения и относительной синхронизации возбуждения и торможения на выходе сетчатки ганглиозных клеток. Динамический зажим использует компьютерное моделирование, чтобы ввести физиологически записанных или …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа выполнена при поддержке Австралийского исследовательского совета (АРК DP0988227) и медико-биологических наук Research Initiative Грант от дисциплины медико-биологических наук, Университет Сиднея. Зажим заплата оборудования усилитель EPC 8 был профинансирован фондом Startup от дисциплины медико-биологических наук, Университет Сиднея. Оборудование InstruTech LIH 8 +8 система сбора данных была приобретена на средства от Rebecca L. Cooper фонда и фонда Startup от дисциплины медико-биологических наук, Университет Сиднея. Мы хотели бы поблагодарить рецензентов за их проницательные предложения и замечания.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane Inhalation Anaesthetic | Pharmachem | ||
| Ames Medium with L-Glutamate (Powder) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES Sodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX Laboratories Inc. | ||
| Equipment | |||
| Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) | Warner Instruments | 64-0794 | |
| Single Stage Glass Microelectrode Puller | Narishinge Japan | Model PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μm Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G | Smith & Nephew (Australia) | ||
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | Model SH-27B | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Olympus Stereomicroscope SZ61 | Olympus Corporation | ||
| Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective | Olympus Corporation | ||
| 0-30 V 2.5 A DC Power Supply | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| Digital Microscopic Camera ProgResMF cool | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp Amplifier EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System | HEKA Elektronik | ||
| Computer: DELL | Dell Corporation |
References
- Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).
- Johnson, D., Wu, S. M. -. S. . Foundations of cellular neurophysiology. , (1995).
- Taylor, W. R., Vaney, D. I. Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina. Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).
- Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. The patch clamp technique in ion channel research. Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).
- Williams, S. R. Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).
- Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
- Feng, S. S., Jaeger, D. The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study. Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).
- Butera, R., Lin, R., Destexhe, A., Bal, T. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. 1, (2009).
- Marco, S. D. i., Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation. The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).
- Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).
- Lobb, C. J., Paladini, C. A. Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique. J. Vis. Exp. (46), e2275 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
- Middleton, T. P., Protti, D. A. Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells. Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).
- Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina. J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).
