Summary

تشغيل الفوق تفاعلات الاحيائية

Published: September 12, 2013
doi:

Summary

وتستخدم Fermentors لزيادة الغلة الثقافة وإنتاجية الخلايا الهندسة البيولوجية. بعد فحص متعددة الميكروبية أو الحيوان المرشحين زراعة الخلايا في قوارير هزة، فإن الخطوة المنطقية التالية هي لزيادة الكتلة الحيوية الثقافة المحدد مع المخمر. يوضح هذا الفيديو الإعداد وتشغيل نظام مفاعل حيوي الفوق نموذجية.

Abstract

وتستخدم نظم التخمير لتوفير بيئة النمو الأمثل للعديد من أنواع مختلفة من الثقافات الخلية. القدرة التي يوفرها fermentors للسيطرة على درجة حرارة بعناية، ودرجة الحموضة، وتركيزات الأكسجين المذاب بشكل خاص يجعلها ضرورية لكفاءة النمو على نطاق واسع من المنتجات والتعبير التخمير. وهذا الفيديو وصف موجز للمزايا المخمر على قارورة هزة. فإنه سيتم أيضا تحديد المكونات الرئيسية لنظام التخمير الفوق نموذجية وإعطاء التعليمات الأساسية في الإعداد للسفينة ومعايرة تحقيقاتها. سيتم إطلاع المشاهد مع عملية التعقيم وأظهرت كيفية تطعيم المتوسطة النمو في السفينة مع الثقافة. كما سيتم أثبتت المفاهيم الأساسية للعملية، وأخذ العينات، والحصاد. كما سيتم مناقشة وتحليل البيانات بسيطة وتنظيف النظام.

Introduction

تكنولوجيا التخمير الأساسية هي امتداد لتقنية بسيطة هزة القارورة للثقافات النمو. أنها انبثقت من الرغبة في السيطرة على بيئات نمو الثقافات الحية بطريقة أكثر اكتمالا والكمي. دفعة قوارير الثقافة هزة تقتصر عادة عن طريق التحكم في درجة الحرارة غير دقيقة. التوحيد درجة الحرارة في شاكر المحتضنة غرفة دافئة أو متغير بدرجة كبيرة، وأحيانا الشرود 5 درجة مئوية أو أكثر من المضبوطة مسبقا المقصود. منذ يتم تحريكها القارورة هزة عادة بسرعة ثابتة، امتصاص الأوكسجين وغاز الصرف محدودة. مرة واحدة يتم استنفاد الأكسجين المحيطة المتاحة، معظم الثقافات تفشل لتزدهر. ليست هناك سيطرة درجة الحموضة في قوارير هزة. في كثير من الحالات، وإذا كانت الثقافة لا يقتصر بواسطة علف الماشية، ويصبح الحمضية إلى حد الإضرار الثقافة والتنفس يبطئ بشكل كبير. تدار معظم الثقافات هزة القارورة أيضا ك "دفعة"، مما يعني أن يتم إطعامهم مرة واحدة فقط عند أو بالقرب من بداية الثقافات inoculatioن. بعد يتم استهلاك هذا المصدر الكربون الأولي، يتوقف الثقافة المتنامية. في بعض الحالات قد ينتقل الأيض والبدء في استهلاك نواتج أخرى في مرق الثقافة، وأحيانا تغيير خصائص الكتلة الحيوية الناتجة أو البروتين. قوارير هزة هي أيضا عادة ما تخضع لفقدان التبخر وسائل الإعلام في البيئات الأكثر دفئا الثقافة، وعادة 10٪ من حجم في 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. هذه الخسارة يغير كثافة الثقافة ويحظر تشغيل طويلة الأجل للنظام. أخيرا، يمكن للمستخدم تواجه رغوة من وسائل الاعلام بعد الانفعالات. وحدوث رغوة في فراغ الرأس فوق ثقافة تحد تبادل الغازات وزيادة النمو خنق.

تم تصميم نظام التخمير الأساسية لمعالجة كل هذه القيود. ويتحقق التحكم في درجة الحرارة حذرا في الأوعية التخمير عن طريق استخدام التحريض المكره وسترة التدفئة. جهاز استشعار إدراجها في سفينة والسيطرة على ردود الفعل التدفئة والتبريد من هذه السترة عادةالنتائج في التحكم في درجة الحرارة ± 0.1 درجة مئوية في جميع أنحاء المضبوطة مسبقا. توفير fermentors الفوق عموما السيطرة على درجة الحموضة عن طريق إضافة كاشف السائل من خلال مضخة. ويتم رصد قيمة درجة الحموضة بشكل مستمر في محاولة للحفاظ على البيئة الأمثل لنمو الخلايا. يتم الاحتفاظ التهوية المناسبة عن طريق خلط المكره المذكورة أعلاه أو عن طريق ضخ الهواء أو الأكسجين تستكمل الغاز مباشرة في الثقافة. مع الثقافات الحساسة القص، والأكسجين غاز تستكمل هو الآلية الرئيسية لصيانة مستوى الأكسجين في الثقافة. وعادة ما يتحقق قياس الأكسجين في حل عن طريق مسبار البولاروجرافي التي لا تتوفر عادة للاستخدام في قوارير هزة. فمن الممكن أيضا أن أضيف بشكل مستمر أو بشكل دوري لتغذية السفينة للحفاظ على النمو بطريقة خطية أو الأسي. يوفر المكثف الغاز الخروج على سطح بارد لبخار في تدفق الغاز العادم لتتكثف، وبالتالي الحفاظ على حجم وكثافة الثقافة. بالإضافة الدوري للمضاد الرغوة السطحي هو دفعتهابواسطة مسبار الموصلية في الثقافة، والحد من الرغوة على السطح والسماح تبادل الغازات.

السفينة، مع كل تحقيقات، والتجهيزات، الضواغط، الأنابيب الحصاد، والأنابيب، يتم تجميعها وتعقيمها في الأوتوكلاف القياسية. بعد المعايرة نتائج التحقيق النهائي وتحقيق الاستقرار لبيئة العمل، يضاف إلى ثقافة السفينة. ويمكن بعد ذلك أن تستخدم نظام لتوصيف الثقافة بطريقة أكثر دقة من الكمية وطريقة اهتزاز مع القارورة. رقابة مشددة من درجة الحرارة، ودرجة الحموضة ومحتوى الأكسجين، واستهلاك العلف، والتبخير السائل، ومستويات رغوة تسهم جميعها إلى الكتلة الحيوية أعلى من ذلك بكثير وأفضل محصول البروتين.

Protocol

تبدأ عملية الإعداد مع السفينة. A المخمر التقليدية من المكونات التالية التي تحتاج إلى تثبيت (الشكل 1): درجة الحموضة جنة التحقيق – لقياس درجة الحموضة في الثقافة الحية. معايرة التحقيق قبل التثبيت وتعقيم مع السفينة. تثبيت التحقيق في headplate. ص 2 التحقيق – لقياس نسبة الأكسجين المذاب داخل السفينة أثناء التخمير. تثبيت في headplate. الأنابيب الحصاد لأخذ عينات من الثقافة. تثبيت هذا المكون ارتفاع قابل للتعديل في headplate. sparger الغاز – يقيم في الجزء السفلي من السفينة ويوفر ضخ الغاز إلى الثقافة. ربط sparger يصل إلى مصدر الغاز على المخمر وجبل في headplate. رمح المكره والمكره – المكره يثير الثقافة وأمر بالغ الأهمية للحفاظ على الاتساق الثقافة في السفينة. مكثف غاز العادم – لتقليل فاقد التبخر في السفينة عن طريق التبريد مسار الغاز العادم. خطوط مضخة كاشف للسيطرة على درجة الحموضة أو إضافة الأعلاف. تنظيف السفينة وheadplate بالماء والصابون. ينصح فرشاة ناعمة لتنقية السفينة وheadplate. التبييض أو المنظفات مع الكلور لا يمكن أن تستخدم لتنظيف السفينة. إذا كانت وسائل الإعلام وليس الحرارة عطوب، إضافة إلى سفينة نظيفة. إضافة فقط حتى يتم التوصل إلى الحد الأقصى لحجم العمل. في هذا المثال، الحد الأقصى لحجم العمل هو 3.3 L لسفينة إجمالي حجم 5 لترات. تحميل headplate السفينة، وضمان أن الختم الدائري س يجلس بشكل صحيح. تثبيت مكثف غاز العادم. تثبيت مضاد الرغوة في التحقيق في الميناء 10 ملم. تثبيت الأنابيب الحصاد في مينائها 10 ملم. وضع قطعة من الأنابيب على أعلى من ذلك والمشبك تشغيله. تثبيت أنابيب و0.20 ميكرون تصفية على مدخل sparge ثم تضييق هذا الخروج. معايرة مسبار درجة الحموضة: جمع 2 مخازن الإشارة في الأكواب الصغيرة، وزجاجة غسل، ووا الغيارش الكأس. ربط الرقم الهيدروجيني التحقيق حتى المخمر وتحويل المخمر جرا. انتقل إلى المعلمة ودرجة الحموضة باستخدام زر القائمة، انتقل إلى الخيار "كال"، ثم اضغط على "أدخل". اختر '2 'ل2 نقطة المعايرة. يغسل تلميح التحقيق ويغرق في المخزن المؤقت إشارة منخفضة. سوف القيمة على استقرار المخمر. استخدام + و – مفاتيح، وضبط القيمة المعروضة لتتناسب مع قيمة درجة الحموضة عازلة المرجعية. بمجرد أن توقف وامض، اضغط على "أدخل". غسل قبالة التحقيق وأدخله المخزن المؤقت الإشارة الثانية. يسمح قيمة لتحقيق الاستقرار ومن ثم استخدام لوحة المفاتيح لجعل القيمة المعروضة تتناسب مع القيمة المرجعية العازلة عالية. اضغط على "Enter للتأكيد. غسل تلميح التحقيق وفصل ذلك من المخمر. وضع قبعة واقية على اتصال وتثبيته في headplate. فتح التحقيق غيض ص 2 وتحقق للتأكد من أن هناكهو بالكهرباء بما يكفي لتغطية الحافة. إذا لم يكن كذلك، إضافة بعض إلى الخزان وإغلاقه احتياطية. تثبيت مسبار ص 2 في headplate وتأكد من أن غطاء يوضع على الأوتوكلاف لحماية التوصيلات الكهربائية الخاصة به. ستكون محسوبة عليه بعد التعقيم. الحصول على زجاجة لتغذية كاشف مع أنبوب تراجع وفلتر الهواء. إضافة مضخة وأنابيب إلى ميناء أنبوب تراجع ونعلق الطرف الآخر إلى مدخل الميناء على المخمر. مكان الأنابيب في كل المنافذ غير المستخدمة ثم المشبك أنابيب الخروج. تثبيت مرشح 0.45 ميكرون على مكثف غاز العادم. هذا الفلتر يضمن أن السفينة لا الضغط في الأوتوكلاف. تأكد من أن جميع الأنابيب التي تذهب دون مستوى وسائل الإعلام وفرضت قبالة لمنع وسائل الإعلام من الخروج. وضع السفينة في الأوتوكلاف ل25 – 30 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية، دورة السائل. الحذر: عندما يخرج فإنه سوف يكون ساخنا جدا. تثبيت السفينة على قاعدة المخمر. عقف درجة الحموضةكابل التحقيق. نعلق كابل التحقيق ص 2. ربط sparger حتى قياس دوار بالإضافة الغاز. Sterilely إضافة 1 M هيدروكسيد الصوديوم كاشف للزجاجة مع أنبوب تراجع وتثبيت رأس المضخة على ضخ قاعدة رأس المغزل. وضع جهاز استشعار درجة الحرارة في و thermowell على headplate. ضمان أن يذهب كل الطريق إلى أسفل و thermowell. خفض الذراع التحريض على اقتران السفن المكره. تأكد من أن المخمر على. تأكد من أن المياه متاحة للالمخمر. بدوره على إمدادات الهواء إلى المخمر. انتقل إلى المعلمة درجة الحرارة وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. اضغط على زر Enter للبدء التحكم في درجة الحرارة. سوف السفينة تسخين في 15 دقيقة أو أقل. تحويل تدفق الغاز إلى 1 حجم الوعاء من وسائل الإعلام في الدقيقة أو أقل. لوضع هذا الأمر، وتدفق الغاز هو 3 لتر / دقيقة. يجب أن تظهر الفقاعات في القاع. انتقل إلى التحريض عarameter وتعيين إلى 300 دورة في الدقيقة. اضغط على "أدخل" لتشغيل الانفعالات. مرة واحدة وصلت درجة الحرارة 37 درجة مئوية، وانتقل إلى المعلمة ودرجة الحموضة وتعيينها إلى 6.8. تحويل السيطرة على درجة الحموضة عن طريق الضغط على زر "أدخل". ضبط الانفعالات إلى أقصى سرعة 1،000 دورة في الدقيقة لتشغيل. تأكد من أن لجنة التحقيق ص 2 هو الاستقطاب بشكل صحيح لعرض القيم المناسبة. بعد 2 ساعة، انتقل إلى المعلمة ص 2 واستخدم زر "القائمة" لتحديد "وظيفة معايرة 'وحدد معايرة (1) نقطة. بعد 15 دقيقة، واستخدام المؤشرات لتعيين القيمة إلى 100 واضغط على "أدخل". وهذا معايرة ص 2. انتقل إلى التحريض وتعيين إلى 300 دورة في الدقيقة. باستخدام زر "القائمة"، وتحويل "تتالي 'إلى' على 'في القائمة الانفعالات. سيؤدي هذا إلى زيادة سرعة الإثارة في محاولة لتقطيع فقاعات الهواء وفرض المزيد من الأوكسجين إلى الحل حيث يزداد الطلب النمو. </لى> انتقل إلى المعلمة ص 2 وتعيين القيمة إلى 30. اضغط على زر Enter للبدء ص 2. بدء حزمة برامج مراقبة على أجهزة الكمبيوتر الشخصية. مرة واحدة يتم معايرة تحقيقات، والإثارة مستقرة عند 300 دورة في الدقيقة، درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية ودرجة الحموضة على مقربة من 6.8، فقد حان الوقت لتطعيم. استخدام الكحول، وتعقيم المنفذ الذي سيتم استخدامه لتلقيح. لفت اللقاح في حقنة وإضافته إلى ميناء تعقيمها. إغلاق الميناء. بمناسبة وقت التلقيح في كتاب السجل. من المهم أيضا أن تأخذ عينة في وقت والتعقيم. تعقيم نهاية الأنبوب أنبوب الحصاد مع الكحول. فتح المشبك تغطي الميناء الحصاد واستخدام حقنة لسحب عينة. يتم تجاهل هذه العينة الأولى عادة لأنه كان يجلس في الأنابيب. استخدام حقنة أخرى لسحب عينة أخرى. مع حقنة الثالث، ودفع الهواء مرة أخرى من خلال الأنابيب لإزالة أكبر قدر حجم القتلىمن سطر والمشبك خارج الخط. تحديد كثافة الخلية ودرجة الحموضة وتسجيل القيم. مع الثقافات الميكروبية، فمن المفيد لتسجيل قيم كل ساعة. الفاصل الزمني الثقافة التابعة. منهجية الحصاد يتوقف على نية للثقافة بعد اكتمال النمو. في هذه الحالة، أخذ عينات من الثقافة مرة أخيرة لتلقي القيم نقطة النهاية لكثافة الخلية ودرجة الحموضة ممكن أو قياس الوزن الرطب الخلية. فتح headplate التخلص من المحتويات في "خزان القتل" المعين مع التبييض أو غيرها من العوامل المضادة للجراثيم.

Representative Results

يمكن تشغيل مفاعل حيوي مع أو بدون برنامج IRIS. ولكن لالتقاط البيانات، فمن الأفضل لاستخدام البرنامج. قبل إضافة البكتيريا، يجب معايرة درجة الحموضة والأوكسجين وأجهزة الاستشعار، مجموعة سرعة المكره ومجموعة درجة الحرارة. في الشكل 2، وقدم إخراج البيانات لتشغيل مفاعل حيوي. تم ضبط درجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية، وسرعة المكره في 200 دورة في الدقيقة. قد يكون معلمات مختلفة لكل تجربة ولكن قبل إضافة البكتيريا، وينبغي أن يكون النظام في حالة مستقرة. في الشكل 3، يظهر التغير في تركيز الأكسجين مع إضافة للثقافة البكتيرية. مجموعة نقاط لهذه التجربة هي 37 درجة مئوية، والنمام في 200 دورة في الدقيقة، O 2 في 70٪. في وقت 19:20، ومضخة تغذية يسلم ثقافة البكتيرية في البذور وOD من 0.1 مما تسبب في إسقاط فورا في مستوى O 2. مفاعل حيوي يستجيب لتغيير مستوى O 2 مع زيادة في تدفق الهواء والمكره السرعة. Tوقال انه تم تعيين مجموعة نقاط للزيادات في سلسلة (الخطوة 35). تم رصد درجة الحموضة المفاعل في الوقت الحقيقي، مع تناقص درجة الحموضة ثم زيادة كما يتبين من تذبذب خط الحموضة على مر الزمن (الشكل 4). ويمكن تحليل المدى بأكمله والمعلمات المعدلة للتجارب لاحقة. الشكل 1. الفوق مفاعل حيوي مع جميع أجزاء وصفت ومتصلة. هذا الرقم يدل على مفاعل خزان أثار في بداية التشغيل. وصفت أجزاء من المفاعل وتشمل أجهزة الاستشعار، والمكره، وقياس درجة الحرارة، وأخذ العينات تغذية الزجاجات، ومنفذ العادم، وقياس ضغط الهواء، وسترة التدفئة، برج المكثف، ولوحة التحكم. الشكل 2. صورة الشاشة من مفاعل حيوي قوات العمليات الخاصة tware في بداية التشغيل. وفي بداية تشغيل خزان أثار، وضبط درجة الحرارة عند 30 درجة مئوية (الخط الأصفر)، وسرعة المكره في 200 دورة في الدقيقة (خط أحمر)، ودرجة الحموضة 6.5 (الخط الأخضر)، وص 2 في 57.2٪ (الخط الأزرق). اضغط هنا لعرض أكبر شخصية . الرقم 3. صورة الشاشة من البرامج مفاعل حيوي أثناء تشغيل ك الأكسجين النقصان. عندما الثقافة هي في مرحلة النمو النشط، فإنه يستهلك الأوكسجين وانخفاض كمية الأوكسجين في مفاعل (الخط الأزرق). عن طريق زيادة سرعة المكره، يمكن إضافة المزيد من الأوكسجين إلى ثقافة (خط أحمر). اضغط هنا لعرض أكبر شخصية . <p class="jove_content" fo:keep-together.within صفحة = "دائما"> الشكل 4. ويتم رصد صورة الشاشة من البرامج مفاعل حيوي يظهر تغير درجة الحموضة مع مرور الوقت. الرقم الهيدروجيني للثقافة باستمرار وبمرور الوقت كما أنه يقلل يتم إنتاج حمض اللاكتيك ومن ثم يزيد كما يتم إضافة قاعدة إلى مفاعل حيوي (الخط الأزرق). اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .

Discussion

المفاعلات الحيوية خزان أثارت هي المعيار في صناعة التكنولوجيا الحيوية واستخدمت لأكثر من 40 عاما 1. كان خزان صغير أثار مهمة لنطاق المتابعة، على نطاق أسفل، سلالة الأمثل، وتوصيف، وعملية التنمية. ويجوز لها أيضا دورا هاما في تطوير الطب فردية 2. مفاعل حيوي على نطاق صغير هو الأكثر مماثلة لفي ظروف الوضع الطبيعي لنمو الخلايا لأنه يمكن رصدها والأمثل طوال شوط. في معظم الأحيان، يتم تنفيذ التجارب الأولية باستخدام قوارير هزة لكن الظروف في مفاعل حيوي الصغيرة تختلف اختلافا كبيرا من القارورة هزة. في تجربة واحدة وجدنا أن ظروف النمو الأمثل للE. لم القولونية وإنتاج بروتين الفلورية الخضراء (GFP) في قارورة يهز لا يترجم إلى خزان أثار (بيانات غير منشورة).

أساليب أخرى من الخلايا نموا في نطاق واسع تشمل زجاجات الأسطوانة، ش واحدحد ذاتها هزاز المفاعلات الحيوية منصة 3 والمفاعلات الحيوية ذات الاستخدام الواحد أكبر مع وحدات التخزين العمل من 50 إلى 5،000 L. كل أسلوب يوفر للتحديات النطاق، ولكن قد وجدت مكانا في الإنتاج. استخدام واحد هزاز منصة مفاعل حيوي يشبه خزان أثار، ويوفر بيئة منظمة. فهو يختلف من خزان أثار في هذا الخلط يحدث بسبب حركة هزاز لتوليد موجات لمنع تصفية الخلايا وتوفير الأوكسجين. والهيدروناميكا لهذا الأسلوب تختلف عن خزان أثار والحد الأقصى لحجم تقتصر على 1،000 L. يمكن للاختلافات تؤثر على نمو الخلايا وإنتاج المنتج. نظم استخدام واحدة أخرى تجمع بين الدبابة أثار مع المفاعل القابل للتصرف ل، وتوفير منصة مع حد أدنى من البنى التحتية والنفقات العامة المرتبطة بها، والقدرة على الإنتاجية العالية التجهيز البيولوجي 4.

المستخدمين الجدد من المفاعلات الحيوية الفوق قد يكون مشكلة في تحديد setpoints الأولية لدرجة الحموضة، ص 2 و تيماحلرارة، ولكن يمكن أن يكون مرجعا لبحث نشر هذه المعلومات 5، 6، 7، 8، 9. مع الثقافات البكتيرية على وجه الخصوص، فمن المستحسن أن تبدأ الإثارة في نفس السرعة كما القارورة شاكر ودرجة الحرارة في نفس المضبوطة مسبقا. ويمكن أيضا ثقافة الرقم الهيدروجيني من قوارير هزة السابقة أشواط أن تستخدم كنقطة انطلاق. تحديد قيمة ص 2 هو أكثر صعوبة وعادة ما يتم تحديد تجريبيا. ومع ذلك، بدءا من 50٪ بو 2 هو نقطة انطلاق الموصى بها.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وكان هذا المشروع دعما جزئيا من قبل جامعة جونز هوبكنز، مكتب وكيل الجامعة من خلال مبادرة العلم عبارة.

Materials

Name Company Catalog Number
LB broth Sigma L3022
ampicillin Sigma A1593-25G
LB broth Sigma L3022
antifoam 204 Sigma A8311
1 M Sodium Hydroxide Sigma 38215-1EA-R
Reference Buffer, pH 4.00 Sigma B5020
Reference Buffer, pH 7.00 Sigma B4770
pO2 probe electrolyte Broadley James AS-3140-C30-0025
0.45 micron filter Cole Parmer EW-02915-22
0.22 micron filter Cole Parmer EW-29950-40
Luer Lock syringe, 10 mL Cole Parmer EW-07940-12
Minifors Bioreactor Infors HT B-Pack 5.0
Air Admiral air pump Cole Parmer EW-79202-00
1175 PD Chilling circulator VWR 13721-204

References

  1. Shuler, M., Kargi, F. . Bioprocess Engineering Basic Concepts. , (2002).
  2. Hambor, J. Bioreactor Design and Bioprocess Controls for Industrialized Cell Processing. BioProcess International. 10 (6), 22-33 (2012).
  3. Julien, C., Whitford, W. Bioreactor, Monitoring, Modeling and Simulation. BioProcess International. 5 (01), S10-S17 (2007).
  4. Fike, R. Nutrient Supplementation Strategies for Biopharmaceutical Production. Part 1: Identifying a Formulation. BioProcess International. 7 (11), 46-52 (2009).
  5. Jana, S., Deb, J. K. Strategies for efficient production of heterologous proteins in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 67, 289-298 (2005).
  6. Wang, Z., Ly, M., Zhang, F., Zhong, W., Suen, A., Hickey, A. M., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. E. coli K5 fermentation and the preparation of heparosan, a bioengineered heparin precursor. Biotechnol. Bioeng. 107, 964-973 (2010).
  7. Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. . Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).
  8. Infors, H. T. . Minifors operating Manual and user guide. , .

Play Video

Cite This Article
Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a Benchtop Bioreactor. J. Vis. Exp. (79), e50582, doi:10.3791/50582 (2013).

View Video