2 단계 콜라게나 제 관류 절차에 의한 인간의 간세포의 분리
Summary
인간 간세포의 분리를위한 수정 된 두 단계의 콜라게나 제 관류 절차가 설명되어 있습니다. 이 방법은 다른 포유 동물의 간장에 적용될 수있다. 고립 된 간세포는 그 같은 간 재생, 약동학 및 독성 등의 분야에서 과학 연구에 적합한 모델을 만들고, 높은 수율과 생존에서 사용할 수 있습니다.
Abstract
간, 뛰어난 재생 능력을 가진 기관은 이러한 해독, 대사 및 항상성 같은 광범위한 기능을 수행한다. 이와 같이, 간세포 연구 문제의 큰 다양성을위한 중요한 모델이다. 특히, 인간 간세포의 사용은 약물 동력학, 독성, 간 재생 및 병진 연구의 분야에서 특히 중요하다. 따라서,이 방법은 Seglen 한 바와 같이하여 간세포를 분리하는 두 단계의 콜라게나 제 관류 절차의 수정 된 버전을 나타낸다.
이전 간세포 기계적 방법에 의해 고립되었다. 그러나, 효소 방법은 간세포 분리 후 자신의 구조적 안정성과 기능을 유지하기로 우수한 것으로 나타났다. 여기에 제시된이 방법은 77 ± 10 %의 가능성을 가진 간세포의 큰 수율 인간의 간 조각과 결과 쥐의 간을 위해 이전에 설계 방법을 적응시킨다. 주이 절차의 차이는 혈관 cannulization의 과정이다. 또한, 여기에 설명 된 방법은 또한 대등 간 또는 혈관 크기를 가진 다른 종에서의 간 적용될 수있다.
Introduction
간세포 현탁액을 기계적 또는 효소 적 방법에 의해 간장에서 제조 될 수있다. 전체 간 세포를 제조하는 데 사용되는 기계적인 방법은, 투박한 (2)를 통해 간을 강제 칸 통 3 유리 구슬 간 조각을 흔들면서, 수년에 걸쳐 등 느슨한 방앗 공이 4,5 유리 균질를 사용하는 등, 기계적인 방법 중 추락 인해 세포막에 손상 및 절연 6,7 간세포의 기능의 상실로 선호. 따라서, 효소 방법의 사용은 현재 간세포의 분리를위한 주요 방법입니다.
베리와 친구 8 쥐의 문맥을 통해 간을 콜라와 히알루을 관류 할 때 효소의 방법을 사용하여 간세포의 분리는 크게 향상되었다. 이것은 재관류 프로세스에 이르는, 효소는 세포의 대부분에 밀착 할 수 있도록 혈관을 살린간세포 8의 수율이 6 배 증가. 또한,이 방법은 사실상 고립 된 소포에 소포체없이 변환없이 미토콘드리아 손상 8, 구조적 무결성을 유지 세포를 얻었다.
이 방법은 간 세포 분리를위한 두 단계 관류 절차를 개척 Seglen 1에 의해 수정되었다. 이 절차에서는 쥐의 간은 칼슘 2 + 1을 포함하는 콜라게나 버퍼 관류 다음에 칼슘 2 + 무료 버퍼 관류한다. 두 번째 단계에서 칼슘 2 +의 첨가가 최적의 콜라게나 제 활성 1,9 필요하면서 제 1 단계에서 칼슘 2 +의 제거는, 데즈 모섬을 방해하도록 돕는다.
상기 게시 된 작품은 쥐에서 수행 된 점을 감안,이 문서는 콧노래에서 높은 가능성을 가진 간세포의 분리에 사용할 수있는 수정 절차를 설명하는 것을 목표로간. 인간 간세포의 사용은 translational 연구를위한 동물 모델을 사용하여 실험을 검증하기위한 중요한 남아있다. 이 연구에 사용 된 인간의 간 조각은 인간의 조직과 세포 연구 재단, 국영 비영리 재단 (10)를 통해 지배 구조에 대한 동의를 획득했다. 병리학 진단에 필요한 있었는지를 제거 한 후, 간 조각이 남아있는 조직에서 수집되었다. 병리학 자에 의해 떨어져 구분 조직 형태 학적으로 간 절제술 후 절제에서 얻은 건강한 조직이었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 높은 생존 능력 및 순도 인간 간세포의 분리가 발생합니다. 이러한 결과를 달성하기 위해, 간 적합한 장으로 시작하는 것이 중요하다. 간 조각은 1 절단면을 제외한 모든 표면에 그대로 Glisson의 캡슐이 있어야합니다. 또 다른 중요한 요인은 다른 배치 소화 11 후 간세포의 생존 정도에서 현저한 차이가 발생할 수 있으므로, 사용 콜라의 특정 배치입니다. 따라서, 콜라게나 제?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 연구를위한 인간의 조직이 사용할 수 있도록 인체 조직 및 세포 연구 재단에 의해 가능하게되었다. 그리고 Hepacult GmbH의이 작품에 대한 재정 지원은 연방 교육 연구부 (: 가상 간 네트워크, 인증 번호 0315759 부여 이름)에서 받았습니다. 우리의 감사는 또한 간 관류 및 간세포 분리를 수행하기 위해 간 샘플 및 세포 격리 코어 시설의 기술 조수의 수집에 대한 Grosshadern 병원 조직 은행의 기술 조수로 이동합니다. 특히, 우리는 비디오에서이 절차를 시연에 Natalja 뢰벤에게 감사의 말씀을 전합니다. 마지막으로, 우리는 비디오의 개략도 그림 1의 그림과 그림을 만들기위한 Natalja 뢰벤 및 Edeltraud Hanesch에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Bubble trap | Gaßner Glastechnik | ||
| Glass jacketed condenser | Gaßner Glastechnik | ||
| 41 °C Water bath | Julabo | 35723-H24/EG | |
| 37 °C Water bath | GFL | 1083 | |
| Compressed gas cylinder (95 % O2/5 % CO2) | Linde | ||
| Gas permeable tubing | Neolab | 2-4440 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | IP65 | |
| Scalpel | Feather | 320010 | |
| Forceps | Omnilab | 5171014 | |
| Conical flasks 1 L | Schott Duran | 2121654 | |
| Conical flasks 5 L | Schott Duran | 2121673 | |
| Beakers | Schott Duran | 2110654 | |
| 200 ml centrifuge tubes | Becton Dickinson | 352075 | |
| Crystallizing dish | Omnilab | 5144063 | |
| Curved irrigation cannulae with ball tips | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
| Micro vascular clamps | Ernst Kratz GmbH | ||
| Büchner funnel | Carl Roth | HT38.1 | |
| Nylon mesh 210 μm | Neolab | 4-1413 | |
| Nylon mesh 70 μm | Neolab | 4-1419 | |
| 0.22 μm sterile filters | Peske | 99505 | |
| 500 ml bottles | Schott Duran | 2180144 | |
| 1 L bottles | Schott Duran | 2180154 | |
| Hemocytometer | Peske | 06-0001 | |
| 1.5 ml tubes | Eppendorf | 0030 120,086 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Ice bucket | Neolab | 1508454 | |
| Sterile Pasteur pipettes | Brand | 747715 | |
| Motorised pipette filler (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
| Refridgerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Laminar flow | Kendro | Hera safe-KS9 | |
| Aspirator (Low-flow surgical suction pump) | Atmos | C361 | |
| Laboratory Gas Burner | Integra | Fire Boy eco | |
| Disposable laboratory coat | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| Surgical mask with visor | Kimberly-Clark | 48247 | |
| Surgical hood | Barrier | 42072 | |
| Latex gloves | Semper Care | CE0321 | |
| Collagenase (Batch number NB 4G) | Serva | 17465 | |
| Calcium chloride dihydrate | Merck | 2382 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
| Hepes | Roth | 9105.3 | |
| Potassium chloride | Serva | 26868 | |
| Albumin | Biomol | 01400-2 | |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Serva | 30180 | |
| 0.4% Trypan blue solution | Lonza | 17-942E | |
| Cold storage solution | Hepacult GmbH |
References
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Schneider, W. C., Potter, V. R. The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 149, 217-227 (1943).
- Aubin, P. M. G., Bucher, N. L. R. A Study of Binucleate Cell Counts in Resting and Regenerating Rat Liver Employing a Mechanical Method for the Separation of Liver Cells. Anat. Rec. 112, 797-809 (1952).
- Anderson, N. G. The Mass Isolation of Whole Cells from Rat Liver. Science. 117, 627-628 (1953).
- Jacob, S. T., Bhargava, P. M. New Method for Preparation of Liver Cell Suspensions. Experimental Cell Research. 27 (62), 453-467 (1962).
- Berry, M. N. Metabolic Properties of Cells Isolated from Adult Mouse Liver. Journal of Cell Biology. 15, 1-8 (1962).
- Laws, J. O., Stickland, L. H. Metabolism of Isolated Liver Cells. Nature. 178, 309-310 (1038).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. The Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of Rat-Liver Cells .3. Enzymatic Requirements for Tissue Dispersion. Experimental Cell Research. 82 (73), 391-398 (1973).
- Thasler, W. E., et al. Charitable State-Controlled Foundation Human Tissue and Cell Research: Ethic and Legal Aspects in the Supply of Surgically Removed Human Tissue For Research in the Academic and Commercial Sector in Germany. Cell and Tissue Banking. 4, 49-56 (2003).
- Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Analytical Biochemistry. 138, 235-237 (1984).
- Smedsrod, B., Pertoft, H. Preparation of Pure Hepatocytes and Reticuloendothelial Cells in High-Yield from a Single-Rat Liver by Means of Percoll Centrifugation and Selective Adherence. J. Leukocyte Biol. 38, 213-230 (1985).
- Cantrell, E., Bresnick, E. Benzpyrene Hydroxylase-Activity in Isolated Parenchymal and Nonparenchymal Cells of Rat-Liver. Journal of Cell Biology. 52, 316-321 (1972).
- Weiskirchen, R., Gressner, A. M. Isolation and culture of hepatic stellate cells. Methods in Molecular Medicine. 117, 99-113 (2005).
- Baccarani, U., et al. Steatotic versus cirrhotic livers as a source for human hepatocyte isolation. Transplant P. 33, 664-665 (2001).
- Renz, J. F., et al. Utilization of extended donor criteria liver allografts maximizes donor use and patient access to liver transplantation. Annals of Surgery. 242, 556-563 (2005).
- Schemmer, P., et al. Extended donor criteria have no negative impact on early outcome after liver transplantation: a single-center multivariate analysis. Transplant Proc. 39, 529-534 (2007).
- Alexandre, E., et al. Influence of pre-, intra- and post-operative parameters of donor liver on the outcome of isolated human hepatocytes. Cell and Tissue Banking. 3, 223-233 (2002).
- Spotnitz, W. D., Burks, S. State-of-the-art review: Hemostats, sealants, and adhesives II: Update as well as how and when to use the components of the surgical toolbox. Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16, 497-514 (2010).
- Spotnitz, W. D., Burks, S. Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox. Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).
- Toriumi, D. M., Raslan, W. F., Friedman, M., Tardy, M. E. Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesives. A comparative study. Archives of otolaryngology–head & neck surgery. 116, 546-550 (1990).
- Vinters, H. V., Galil, K. A., Lundie, M. J., Kaufmann, J. C. The histotoxicity of cyanoacrylates. A selective review. Neuroradiology. 27, 279-291 (1985).
- Bhogal, R. H., et al. Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience. PloS ONE. 6, e18222 (2011).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).
- Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices. ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. . The principles of humane experimental technique. , (1959).
