通过双折射和触诱发逃逸反应检测分析斑马鱼幼虫骨骼肌缺陷

摘要

斑马鱼现已成为研究肌营养不良症、先天性肌病及相关神经肌肉疾病的重要且强大的模型工具。双折射和触觉诱发逃逸行为是两种常用的非侵入性检测方法，用于评估斑马鱼胚胎在早期发育过程中肌肉结构紊乱和运动功能障碍的程度。

摘要

斑马鱼（Danio rerio）因其与哺乳动物在基因组和结构上具有高度保守性^1-3，已成为模拟影响骨骼肌的人类疾病的有力模型，包括肌营养不良症^4,5、先天性肌病^6,7以及肌节组装异常⁸。在受精后的最初几天内，可快速评估斑马鱼的肌肉紊乱和运动功能障碍。用于表征斑马鱼骨骼肌缺陷的两种检测方法是双折射检测（结构性）和触碰诱发逃逸反应检测（行为性）。

双折射是一种物理特性，指光在穿过有序物质（如肌节的类晶体阵列⁹）时发生偏转的现象。这是一种简单、无创的方法，可用于早期发育阶段对透明斑马鱼幼鱼的肌肉完整性进行评估。当在两个偏振光滤光片之间观察时，具有高度有序骨骼肌的野生型斑马鱼在暗背景中呈现非常明亮的形态，而肌肉突变体则表现出与其所模拟的主要肌肉疾病相对应的特异性双折射模式。模拟肌营养不良症的斑马鱼模型——这类疾病以肌纤维变性继而反复再生为特征——在偏振光下骨骼肌中会显示出退行性的暗斑。非营养不良性肌病不伴有坏死或再生性改变，但会导致肌纤维排列紊乱和骨骼肌无力。肌病型斑马鱼通常表现为整体双折射强度降低，反映出肌节结构的紊乱。

触觉诱发逃逸实验通过观察胚胎在受到触觉刺激后的游泳行为来进行^10-12与野生型幼虫相比，突变型幼虫常表现出微弱的逃避收缩反应，随后出现缓慢游泳或其他类型的运动障碍，无法使幼虫移动较远距离¹²这些检测方法的优势在于可以对同一种鱼类的疾病进展进行监测 体内 数天，且相较于高等脊椎动物，可在短时间内分析大量鱼类。

方案

1. 在体 通过双折射分析骨骼肌结构

1. 在下午喂食后，将所需斑马鱼品系的雄鱼和雌鱼分开放入交配笼中。
   1. 通过较大的腹部和略带蓝/白色的体色区分雌性，通过较纤细的体型和粉/黄色的色调区分雄性。
   2. 采用单对交配（一雄一雌）的成功率可能仅为约50%。为提高成功率，建议将一只雄性与2–3只雌性共同交配。
2. 第二天早晨在光照开始后不久移除鱼缸隔板，让鱼类不受干扰地产卵。
3. 当水族箱底部产有足够数量的受精卵时，使用滤网收集卵。
4. 将胚胎转移到深型培养皿中，用鱼水冲洗过滤筛，并将亲代鱼放回鱼缸。将盛有胚胎的培养皿置于28.5 °C培养箱中。
5. 当天晚些时候或次日早晨清除无法存活的卵和碎片，并将胚胎放回培养箱中继续培养。
6. 胚胎/幼鱼在受精后3至7天（dpf）达到观察双折射现象的适宜年龄，因为在3 dpf之前观察结果可能因对比度不足而受限。野生型胚胎在受精后48至60小时（hpf）从绒毛膜中孵化，随后身体轴线逐渐伸直。孵化较晚的野生型或突变型胚胎可能需要人工去绒毛膜处理。
   1. 用尖头镊子轻轻撕开绒毛膜，然后将其倒置，使胚胎脱出。
   2. 让去壳胚胎在开始检测前充分伸直。
   3. 用三卡因（鱼水中含0.04%）麻醉胚胎，以利于其正确摆放。
7. 将解剖显微镜配备可旋转的偏振镜头，以调节偏振光的角度（图1A).
8. 将去壳并麻醉的胚胎直接放置在显微镜载物台上位于上层偏振片下方的第二个偏振片上，沿胚胎体轴的侧向摆放。第二个偏振片应置于显微镜载物台上的上层偏振片下方。图1B在整个双折射检测过程中，请勿使用塑料培养皿，因为塑料不适合作为折射光传播的介质。
9. 旋转上层透镜，使目标胚胎保持在视野中，直至两个透镜的偏振轴相互垂直（呈90°），背景完全变暗。
10. 检测的最佳结果取决于鱼类在两个偏振镜头之间的摆放方向。移动鱼类，确保其尽可能平躺。
    1. 如果鱼体发生弯曲，只有呈平坦取向的节段才能透过偏振光并表现出双折射现象。在此情况下，应测量平坦区域的双折射，并记录野生型鱼相应区域的双折射值例如. 野生型和突变型鱼的第1至第10体节。
11. 观察鱼类的双折射表型。
    1. 具有高度有序骨骼肌的野生型鱼表现出明亮的双折射现象，因为平行于肌丝的光线折射率高于垂直于这些结构的偏振光。
    2. 骨骼肌排列紊乱、提示为非变性性肌病或发育缺陷的鱼类通常表现出双折射的整体性减弱。
    3. 患有肌肉营养不良症且骨骼肌结构紊乱的鱼类通常表现出斑块状的双折射模式，其中暗区代表退化的肌肉，而亮区为正常的肌肉结构。
12. 在相同的曝光设置和放大倍数下，利用偏振光对野生型和突变型斑马鱼进行成像，以量化双折射现象。将图像保存为 .tiff 文件。
    1. 在 ImageJ 软件中打开双折射图像（http://rsbweb.nih.gov/ij/).
    2. 对于每张图像，使用工具栏中的“多边形选择”选项，围绕鱼体绘制线条以选定斑马鱼肌肉区域。
    3. 在“分析”下拉菜单中使用“设置测量”以选择图像所需的统计参数。
       1. 最小选择要求勾选“Area”、“Mean gray value”和“Min”复选框 & 最大灰度值” 已勾选。
       2. 最大灰度值 >255 表示像素饱和。因此，请使用最大灰度值小于 255 的图像。
    4. 将平均强度根据所选区域进行归一化，并对每张双折射图像重复相同的定量分析步骤。

2. 触发逃逸行为检测

1. 按照上述步骤 1.1–1.5 所述，设置适当斑马鱼品系的交配对并收集胚胎。
2. 在受精后 2–7 天，将去壳的胚胎/幼鱼单独放入深型培养皿或多孔板的孔腔中。
3. 每次仅操作一个胚胎，将胚胎置于 Nikon SMZ1500 体视显微镜 配备 SPOT RT3 数字相机系统 或类似设备的视野中央，开始进行序列成像。
   1. 野生型和突变型鱼应采用相同的成像频率。建议帧率>30 Hz，因为较低的帧率通常不足以捕捉野生型鱼快速的游泳行为。
4. 通过用昆虫针触碰胚胎尾部，施加机械感觉刺激。
5. 当胚胎停止游泳或游出视野时，停止成像。
6. 使用 SPOT 5.1 Advanced 软件将序列图像转换为视频文件，或对延时图像的单帧进行离线分析。类似软件包括 Open Lab、NIS Elements 或免费软件 ImageJ（http://rsbweb.nih.gov/ij/）。
7. 通过在多个胚胎中执行触诱发应答来量化游泳行为。
   1. 可通过使用软件或刻度尺标记游泳过程的起点和终点，计算固定时间间隔内胚胎游泳距离的平均值来实现。
   2. 为避免胚胎随时间推移对触觉刺激产生习惯化，每次实验重复应使用新的胚胎。野生型和可靠的突变型模型的行为通常具有高度可重复性。

结果

双折射可作为一种高效、非侵入性的检测方法，用于揭示活体斑马鱼胚胎中肌原纤维的组织状态。本文展示了野生型斑马鱼以及骨骼肌发育和功能相关基因表达降低的斑马鱼实例。在偏振光下，5天龄的野生型斑马鱼由于肌丝排列有序，其骨骼肌表现出强烈的双折射现象（图2A-B）。相比之下，携带dag1基因致病性突变的同龄纯合子胚胎则呈现斑片状双折射，提示存在肌肉退化区域（图2C-D）²。这种斑块样模式以及在早期发育过程中肌肉退化的快速进展，与其他肌营养不良型鱼类模型一致^1,3。对5天龄dag1突变体（肌营养不良型）的双折射进行定量分析，发现其亮度显著降低至野生型同胞最大双折射值的27.9%±5.3，降低程度比3天龄肌病型mtm1吗啉代寡核苷酸敲降胚胎中观察到的52.4%±5.5更为严重（野生型/dag1/mtm1：n = 3；Student's t检验，P < 0.001）（图4）。肌病型鱼类模型（图3C-D）通常与野生型（图3A-B）相比整体双折射减弱，这是因为主要轴向骨骼肌中常出现肌原纤维排列紊乱，但无退行性改变的证据。

通过触觉诱发的逃避行为可用来证明骨骼肌疾病斑马鱼模型表现出运动缺陷和游泳困难。采用视频显微镜结合触觉诱发逃避行为实验，观察野生型与dag1突变型斑马鱼的活体游泳表型（视频1和2）²。随后逐帧分析视频，以确认在受到触觉刺激时，dag1突变体相较于野生型对照组表现出运动能力受损（图5）。两种类型胚胎在固定时间间隔内移动的距离取平均值（野生型：6.2±0.4 cm/0.1 sec，n = 10；突变型：0.75±0.08 cm/0.1 sec，n = 10；Student's t检验，P < 0.001），表明dag1突变体的运动功能减弱。然而，神经肌肉突变体中触觉诱发反应的降低也可能归因于中枢神经系统和/或神经肌肉接头的缺陷。因此，通过触觉刺激诱发肌肉电压反应的电生理测量，有助于区分触觉诱发功能障碍是源于感觉缺陷，还是源于骨骼肌本身的原发性缺陷¹³。

图1. 配备相机和偏振镜头的标准解剖显微镜示意图（A）。偏振镜头与麻醉的斑马鱼胚胎样本装置的放大图显示于（B）。 点击此处查看大图。

图2. 野生型斑马鱼在5 dpf时表现出明亮的双折射，表明肌肉组织高度有序（B）。在明场光下，同龄的dag1突变体斑马鱼外观大致正常，而在偏振光下，大多数体节出现广泛的肌肉退化，表现为双折射信号的丧失，符合肌营养不良表型（D）。为便于对照，展示了野生型斑马鱼（A）和dag1突变体（C）的明场图像。点击此处查看高分辨率图像。

图3. 基于吗啉环寡核苷酸敲低斑马鱼中的肌管蛋白（mtm1）导致3 dpf时骨骼肌出现缺陷。 与野生型鱼（B）相比，mtm1 吗啉环寡核苷酸处理组鱼（D）表现出双折射性整体降低，符合肌病表型。为作参考，展示了野生型鱼（A）和mtm1 吗啉环寡核苷酸处理组（C）的明场图像。点击此处查看高分辨率图像。

图4. 与野生型对照相比，具有骨骼肌缺陷的斑马鱼胚胎表现出显著降低的双折射强度。 定量数据通过将平均强度除以选定的鱼体区域（ImageJ）计算得出，并将百分比数值相对于野生型进行归一化处理。数据以均值±标准误（SEM）表示，** 表示经Student t检验，P < 0.001。点击此处查看高清图像。

图 5. Dag1 突变型胚胎在 5 dpf 时表现出降低的触觉诱发反应（E-K），而机械感觉刺激可导致 5 dpf 野生型胚胎迅速游走并完全离开视野（A-D）。 比例尺 = 1 mm。 点击此处查看高分辨率图像。

视频 1. 野生型斑马鱼触碰诱发的逃避行为检测。 正常的幼鱼（5 日龄）在受到触碰刺激时会迅速游开。点击此处观看视频。

视频 2. 触发诱导逃避行为检测实验 dag1 突变型斑马鱼 Dag1 5日龄幼鱼对触碰反应迟钝，且无法移出视野范围。 点击此处观看视频

讨论

原发性神经肌肉疾病传统上被分为肌营养不良性和非肌营养不良性病变。肌营养不良症的特征是肌纤维变性，随后经历多轮再生，最终发展为以纤维化和脂肪组织替代为典型表现的终末期病变¹⁴。相比之下，非肌营养不良性肌病不伴有坏死或再生性改变，但仍会导致肌纤维结构紊乱及整体骨骼肌无力。

斑马鱼模型近年来已成为深入理解各种神经肌肉疾病分子通路及发病机制的极为宝贵的资源。除了该模型系统本身所具有的普遍优势，如发育迅速 子宫外 发育迅速、胚胎透明、繁殖能力强，且基因组与人类高度相似，斑马鱼疾病模型通常能高度模拟人类疾病。尽管许多骨骼肌缺陷的斑马鱼存在形态学异常，但部分突变体表型总体正常，需要更精细的表征分析。对于此类情况及所有其他情形，均可通过非侵入性方法快速、简便地评估斑马鱼肌肉损伤和肌力减弱的程度 体内 双折射和触碰诱发逃避行为的检测方法。双折射是透明斑马鱼胚胎中肌肉完整性的敏感指标，自斑马鱼模型系统建立初期以来，已被用于无创鉴定骨骼肌突变体。¹⁵该检测方法本身是将斑马鱼胚胎置于两个偏振滤光片之间，在暗背景下观察鱼体¹⁶野生型鱼类具有高度有序的肌节结构，呈现明亮的双折射图像，而肌肉突变体通常表现出暗斑或整体双折射强度降低，提示主要轴向骨骼肌中肌原纤维排列紊乱。如上所述，可利用公开可用的ImageJ软件对双折射图像进行定量分析。 软件

斑马鱼的触觉诱发逃逸行为涉及多个步骤，从触觉刺激的感知开始，最终导致肌肉收缩。斑马鱼胚胎在受精后26小时（hpf）即能对触碰产生游泳反应，但游泳过程中肌肉收缩的频率直到36 hpf才达到与成年斑马鱼相当的水平^12,18。触觉诱发反应的最佳观察时间为受精后2至7天（dpf）。实验中将触碰尾部的时间点设定为“起始”时间点。野生型和突变型幼鱼在刺激前均处于静止状态，但视频显微镜可清晰记录到，野生型幼鱼在机械感觉刺激下会迅速且有力地沿直线游泳。而肌肉功能缺陷的突变体则通常仅表现出微弱的弯曲、环状游泳，或仅能短距离移动。需要注意的是，尽管人工触碰刺激在时间和强度上存在一定程度的固有变异性，但在野生型以及可靠的骨骼肌疾病鱼类模型中，对触觉诱发行为和游泳事件的定量测量通常具有高度可重复性。

双折射和触觉诱发逃避实验均可快速、无创地分析骨骼肌缺陷，因此在进行高通量诱变或化学筛选时，适用于大量胚胎的分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三卡因	Sigma	A5040
培养皿	Fischer Scientific	0875711Z
镊子	Fischer Scientific	100189-588
昆虫针	Fischer Scientific	S67375
偏振镜片	Ritz Camera	Quantaray Tristar Optics C-PL 72mm
培养箱	Fischer Scientific	Isotemp Incubator Model 630D
显微镜	Nikon Instruments Inc.	SMZ 1500
相机	Diagnostic Instruments Inc.	SPOT RT3
成像软件	Diagnostic Instruments Inc.	SPOT 5.1 Advanced