זיהוי מהיר של חיידקים גראם שליליים מהדם תרבות מרק שימוש MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית
Summary
היישום של desorption זמן בסיוע מטריקס לייזר / יינון של טיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטריית מסה (MS) ישירות למרק תרבות דם מזרז את זיהוי של חיידקים. השיטה שהוצגה היא שיטה מהירה ואמינה לזיהוי של חיידקים גראם שליליים ישירות ממרק תרבות דם.
Abstract
תפקיד חשוב של המעבדה למיקרוביולוגיה הקלינית הוא לספק זיהוי מהיר של חיידקי גורמי זיהום דם. זיהוי מסורתי דורש תת התרבות של מרק תרבות הדם אותת עם זיהוי זמין רק לאחר שמושבות על אגר מוצק הבשילו. MALDI-TOF MS היא שיטה אמינה, מהירה לזיהוי של רוב החיידקים רלוונטיים מבחינה קלינית, כאשר חלים על מושבות על תקשורת מוצקה. היישום של MALDI-TOF MS ישירות למרק תרבית דם הוא גישה אטרקטיבית שכן יש פוטנציאל להאצת זיהוי מינים של חיידקים ולשפר את הניהול קליני. עם זאת, בעיה חשובה להתגבר היא ההסרה טרום הניתוח של רפים, חלבונים להתערב והמוגלובין הכלולים בדגימות דם שתרבות, אם לא יוסרו, להפריע לספקטרום MS ויכול לגרום לציון הזדהות אפליה בלתי מספיק או נמוך. בנוסף יש צורך להתרכז bacterIA לפתח ספקטרום באיכות מספקת. השיטה המוצגת מתארת את הריכוז, טיהור, והפקה של חיידקים גראם שליליים המאפשרים זיהוי המוקדם של חיידקים ממרק תרבות הדם אותת.
Introduction
חולים עם זיהום דם (BSI) עקב חיידקים ימשיכו להיות גבוהה לתמותה בבית החולים, החל 6-48% 1. המשלוח של אנטיביוטיקה אמפירית מתאימה מקדם הישרדות ובתת הקבוצה של חולים עם אלח דם חמור, כל עיכוב של שעה לטיפול מתאים בקורלציה לירידה בהישרדות 2,3. בהתאם לכך, מטרה מרכזית של המעבדה הקלינית היא לזהות במהירות, לזהות ולתקשר את נוכחותם של חיידקים בתרביות דם להודיע החלטות קליניות. זה כבר הוכיח כי יש לו את המעבדה למיקרוביולוגיה ההשפעה הגדולה ביותר על טיפול מיקרוביאלית בעת דיווח על כתם גראם 4 ולאחרונה, מחקר תצפיתי, הוכיח כי זמן desorption הלייזר בסיוע מטריקס / יינון של ספקטרומטריית מסת טיסה (MALDI-TOF MS) מבוצע ישירות על מרקי תרבות הדם להשפיע על קביעת בלמעלה שלישית של BSI אחת נגרמים על ידי חיידקים גראם שליליים 5.
<p class="Jove_content"> הפיתוח המסחרי של MALDI-TOF MS הוביל לכלי מעבדה יעיל לזיהוי מיקרואורגניזמים 6,7. טכנולוגיית החברה מבוססת היטב וכבר השתלבה במעבדות רבות לזיהוי מהיר ומדויק של מיקרואורגניזמים, הפרד, 6,8 תקשורת המוצק. היישום הישיר של MALDI-TOF MS לתרבות דם מרק (BC) שסמן "חיובי" לערעורי מיקרואורגניזמים לשני הרופאים ומנהלי מעבדה בגלל הפוטנציאל להשיג זיהוי מוקדם של מיקרואורגניזמים בעלות נמוכה.התועלת הקלינית של יישום הישיר של MALDI-TOF MS למרק תרבית הדם הייתה מוגבלת על ידי מגוון הרחב של רגישויות שנצפו בהשוואה לשיטות המבוססות על תרבות פנוטיפי סטנדרטית של הזדהות, עם דיווחים על זיהוי המוצלח של חיידקים גראם שליליים הנעים 47-98.9 % 9-11. הווריאציה ברגישות סבירהמתייחס להרכב לפנה"ס המרק, ריכוז חיידקים ראשוני, הווריאציה בשיטות הכנת מדגם, כמו גם המערך של אורגניזמים שליליים גרם נתקלו באוכלוסיות מחקר 9. לעומת פרוטוקולים שפורסמו אחרים אלה בשיטה שהוצגה כאן תמנע את השימוש באתנול, אמוניום כלוריד או אצטוניטריל נוסף (לא מטריצה). כתוצאה מכך גלולה החיידקים תישאר קיימא (עד לנקודה של מיצוי חלבון) המאפשרת לשיטות בדיקת רגישות פנוטיפי פוטנציאל להיות מיושמות ישירות לאורגניזמים אלה במרק. בנוסף, השיטה שהוצגה הוכח להיות זול, אמין ומהיר עם זיהוי חיידקים זמין בתוך 25 דקות של תוצאות כתם תרבות הדם גרם, עם מינימליות "ידיים על" זמן 12.
שיטה זו היא פרוטוקול פשוט בתוך בית הספין תמוגה ניצול מיצוי חומצה פורמית מיושם ישירות למרקי תרבית דם חיוביים לזהות b השלילית גראםacteria עם טכנולוגית MALDI-TOF MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
חשוב בעת החלת MALDI-TOF MS למרק תרבית דם שהצעדים שלאחר צנטריפוגה מבוצעים בזהירות מספקת לא לערבב את המרכיבים המופרדים. זה חשוב במיוחד כדי להסיר את מרכיבי תרבות דם וחלבונים תאיים אנושיים, כולל המוגלובין, אשר עשוי לייצר קוצים מפריעים לספקטרום MALDI-TOF.
<p class="jove_content" style=";text-align:…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| BACTEC Plus Aerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442192 | |
| BACTEC Lytic/10 Anaerobic /F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442265 | |
| BACTEC Peds Plus Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442194 | |
| Vacutainer – Blood transfer device | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 364880 | Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury |
| Vacutainer SST 5.0mL, Advance plus | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 367954 | Serum separating tube |
| Syringe 10 mL | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 302143 | |
| Transfer pipette | Samco, USA | 222-20S | |
| Transfer pipette (fine tipped) | Samco, USA | 232-20S | |
| Microcentrifuge tube (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030.120.094 | |
| Sterile water (DNAse and RNAse free) | Life Technologies, Carlsbad, California, USA | 10977-015 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | F0507 | |
| Matrix solution | Bruker Daltonics, Bremen Germany | 285074 | 10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid |
| Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS | Bruker Daltonics, Bremen Germany | Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software |
References
- Bearman, G. M., Wenzel, R. P. Bacteremias: a leading cause of death. Arch. Med. Res. 36 (6), 646-659 (2005).
- Leibovici, L., Shraga, I., Drucker, M., Konigsberger, H., Samra, Z., Pitlik, S. D. The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream infection. J. Intern. Med. 244 (5), 379-386 (1998).
- Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit. Care Med. 34 (6), 1589-1596 (2006).
- Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J. Clin. Microbiol. 41 (1), 495-497 (2003).
- Clerc, O., Prod’hom, G., Vogne, C., Bizzini, A., Calandra, T., Greub, G. Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry on the Clinical Management of Patients With Gram-negative Bacteremia: A Prospective Observational Study. Clin. Infect. Dis. 56 (8), 1101-1107 (2013).
- Dekker, J. P., Branda, J. A. . MALDI-TOF Mass Spectrometry in the Clinical Microbiology Laboratory. Clinical Microbiology Newslette. 33 (12), 87-93 (2011).
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Infect. Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
- Neville, S. A., et al. Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification. J. Clin. Microbiol. 49 (8), 2980-2984 (2011).
- Schmidt, V., Jarosch, A., März, P., Sander, C., Vacata, V., Kalka-Moll, W. Rapid identification of bacteria in positive blood culture by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (3), 311-317 (2012).
- March-Rosselló, G. A., Muñoz-Moreno, M. F., de Urriés, M. C., Bratos-Pérez, M. A. A differential centrifugation protocol and validation criterion for enhancing mass spectrometry (MALDI-TOF) results in microbial identification using blood culture growth bottles. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 32 (5), 699-704 (2012).
- Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J. Clin. Microbiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
- Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Iredell, J. R., Chen, S. C. Rapid identification of Gram-negative organisms from blood culture bottles using a modified extraction method and MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 72 (2), 110-112 (2013).
- Hazelton, B. J., Thomas, L. C., Unver, T., Iredell, J. R. Rapid identification of Gram-positive pathogens and their resistance genes from positive blood culture broth using a multiplex tandem RT-PCR assay. J. Med. Microbiol. 62 (2), 223-2231 (2013).
- Saffert, R. T., Cunningham, S. A., Mandrekar, J., Patel, R. Comparison of three preparatory methods for detection of bacteremia by MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73 (1), 21-26 (2012).
- Consoir, C., Lörch, D., Schneider, C. Direct identification of bacteria from charcoal-containing blood culture bottles using matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (10), 2843-2850 (2012).
- Martiny, D., Dediste, A., Vandenberg, O. Comparison of an in-house method and the commercial Sepsityper™ kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (9), 2269-2281 (2012).
- Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16 (11), 1631-1638 (2010).
- Novel, , et al. improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).
- Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database. J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).
