This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.
在内部施肥动物,精液通常添加到精子,共同形成了精液或精液。除了滋养和激活精子,在精液的成分也能影响女性生理,以增加捐赠者的精子受精成功。虽然许多研究报告中的物种有独立的男女这样的效果,很少有研究的同时雌雄同体的动物,解决了这个。这个视频协议提出来研究腹精液效果的方法,用一个雌雄同体的同时淡水螺,大池塘蜗牛椎实螺stagnalis,作为模式生物。而该过程是使用完整的前列腺提取物所示,各个部件的精液( 即 ,蛋白质,肽,和其它化合物)可以以相同的方式进行测试。收据上产蛋精液成分的影响可以量化的产蛋频率方面和女性生殖性能,如每个卵块中卵的数字更微妙的估计。结果表明,精液中的蛋白质会影响在此同时雌雄同体雌性生殖输出,突出性选择的重要性。
转让时,精子通常伴随着由雄性附腺产生的精液。虽然一些精液成分的滋养和激活精子1发挥作用,影响其他女性生理为了增加精子捐赠者2-4受精成功。尤其是选择了这样的效果的,通过性选择,当一个物种是高度混杂和有效率的储存精子和精子消化。在这种情况下,精子捐赠者的卵子5的施肥严重竞争。虽然有丰富的相关性证据的精液物质对男性受精成功的重要性,直接的证据是比较罕见的,很少有研究钻研的生理变化和/或参与6种物质的详细信息。
在物种雌雄分开( 即男性和女性; gonochorists)有一些良好的研究模型SPECI当涉及到精液成分和它们的影响上课。例子包括果蝇, 果蝇6,疟蚊, 冈比亚按蚊 7,赤拟谷盗, 赤拟谷盗 8。例如精液的研究更是少之又少,当涉及到那些同时雌雄同体( 即个人在功能上是男性和女性的同时),即使复制这种模式是常见的整个动物王国9种。一个附属性腺物质转移的最显着的雌雄同体的例子可能就是所谓的爱飞镖土地蜗牛2,10,该物质是由捐精者通过皮下注射11,12, 即 ,不转移,但拍摄随着精子。但也有转移雄性附腺的产品以及它们的精子许多同时雌雄同体,如这里所使用的模型种类,伟大的池塘蜗牛椎实螺stagnalis。以前的研究已经证明,收据精液的影响该物种的13-15的女性生殖输出和几个参与精液的蛋白质已被确定16,17。
这个协议,这是报告中KOENE 等[16]的方法扩展的总体目标,是检验精液蛋白对产蛋的腹足软体动物各种参数的影响。这是由前列腺( 即男性附属性腺产生的精液),从一个标准化的实验室培养分离出的性捐助蜗牛的解剖完成。二,捐赠者的精子来自精囊腺收集和不同的治疗方案而作出调整。随后,测试蜗牛麻醉和阴道内注射的试验溶液(例如,单独前列腺提取物,前列腺提取物与精子,精子单独,独自载体介质)。这些测试蜗牛,然后在接下来的几天监测到数周,在标准条件下,记录产卵。卵块收集,数字扫描计数和测量各种参数,然后放在小瓶单独孵化。大约两个星期后,幼体进行计数和数字扫描。所有的扫描无论卵块和幼体,使用可免费提供的图像分析软件包,然后进行分析。
对于这个协议的伟大池塘蜗牛, 椎实螺stagnalis,实验室菌株使用,这是孕育在VU大学在阿姆斯特丹。本种作为调查有关性选择和雌雄同体再现问题的模型系统。动物的比较大的尺寸使得它的实验非常方便。此外,因为它被用作模型物种在许多biological学科我们已经知道了很多关于这些动物的基本生物学。这种方法能帮助研究关于性选择那些一般通过精液蛋白介导的过程问题。此外,因为这些都是同步雌雄同体,有可能解决这样的蛋白质是否在相似和/或不同的方式行事,因为他们在那里的两性分开16,17物种。
所提出的方案显示了如何收集精液,以及如何在生物学上有意义的方式来测试这一点。虽然在这里该程序使用的前列腺提取物被示出,一个单一纯化的精液蛋白的效果,也可以按照相同的程序进行测试。显然,在这样的测试中,它始终是至关重要的,以包括适当的对照组(假手术处理),以确保该程序和/或所述载体介质不会影响问题14,16的参数。使用这种方法时,它已经被证明是有一个单一的精液蛋白,即Ovipostatin,其介导在产蛋14,16的减少。这种蛋白质,产生在前列腺和沿与精子交配期间传输,表示在一个同步雌雄同体第一充分表征精液成分和不,到目前为止,没有发现任何的相似已知的蛋白质。
这一发现,Oviposta锡降低产蛋量产收件人证实了早期的工作表明,在精液中的物质可能会影响产蛋13-15。通过将生物相关的量(见3.2 16),一个可以令人信服地表明,它是一个精液蛋白,并没有精子的存在本身,其介导所观察到的减少产卵( 图1)。考虑到通过自然交配多次收到精液每增加15蛋的投资,它现在变得高度相关的量化产蛋的其它参数。所提出的方案现在提供了必要的方法来这样做。虽然没有影响,发现Ovipostatin对孵化由收件人16下的蛋的成功,有可能是一致行动与该蛋白的其他精液蛋白。因此,需要进行量化在这方面的参数 – 旁铺设频率和产蛋数量 – 包括鸡蛋大小,HATC兴时,幼体发育和幼体大小。另外,也可以看看其他女性的进程比产蛋,如精子储存和使用情况,以及生殖资源对女性和男性功能14,17的分配效应。显然,该方法是有助于解决这些后续问题,无论是在椎实螺stagnalis和其他淡水螺。
总之,使用该协议显示实验,转精液的蛋白质会影响收件人在这些同时雌雄同体的女性生殖性能。由于很少有研究涉及这一点,它很可能是多在内部施肥雌雄同体比目前反映在科学文献中更常见。特别是当人们意识到预交配择偶和精子竞争已经显示出在这些雌雄同体14,发挥了重要作用的highlighTS以在该系统中通过性选择成雄性附腺的蛋白质的潜力。最后,本研究有助于支持显影概念,精液蛋白是用于同时雌雄同体同等的重要性,因为它们是独立的,性别鉴定物种。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢MR Helmus的画外音,CM Popelier,S. Ypenburg和C Levesque的技术援助。这项研究是由荷兰科学研究组织(NWO),艺术与科学的荷兰皇家科学院(KNAW)和日本学生支援机构(JASSO)的财政支持。本出版物是由苏国的开放获取授予JMK支持。
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
fish food flakes | TetraPhyll | ||
stereo microscope | |||
small surgical scissors | WPI | ||
coarse and fine forceps | WPI | ||
10 ml syringe | |||
injection needles (0.3mmx13mm) | |||
50 Mm MgCl2 | |||
5.83 mmol L-1 CaCl2•2H2O | |||
3.76 mmol L-1 MgCl2•6H2O | |||
42.69 mmol L-1 NaCl | |||
37.53 mmol L-1 KCl | |||
Two component Silicon | Sylgard | ||
1 mm syringes | |||
Silicon tubing (diameter 1 mm) | |||
blunted injection needles (0.3mmx13mm) | |||
Tubes | Eppendorff | ||
460-ml perforated containers | |||
metal leaf puncher (19.6 cm2) | |||
spatula/spoon | |||
(laptop) computer | |||
flatbed scanner | |||
millimeter scale | |||
transferring plates | |||
glass tiles | |||
20 ml glass vials |