我们基于发育生物学知识和已发表的研究，开发了一种优化的方案，可高效地从人类胚胎干细胞和人类诱导多能干细胞中生成A9型中脑多巴胺能神经元，该技术将有助于帕金森病的疾病建模及细胞替代治疗。
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摘要
摘要
中脑黑质致密部中的多巴胺能（DA）神经元（也称为 A9 DA 神经元）是帕金森病（PD）中特异性丢失的细胞类型。目前，人们高度关注从人多能干细胞（hPSCs）中获得 A9 DA 神经元，以用于 PD 的再生性细胞替代治疗。在神经发育过程中，A9 DA 神经元起源于位于中枢神经系统腹侧中线的底板（FP）前体细胞。在此，我们优化了 hPSCs 分步分化为 A9 DA 神经元的培养条件，该过程模拟了胚胎期 DA 神经元的发育过程。在本方案中，我们首先描述了利用小分子方法从 hPSCs 高效生成 FP 前体细胞，随后将这些 FP 细胞转化为 A9 DA 神经元，并可长期维持 体外 数月。该高效、可重复且可控的方案在来自正常人及帕金森病（PD）患者的正常人源胚胎干细胞（hESCs）和人源诱导多能干细胞（hiPSCs）中均表现良好，可由此获得A9类多巴胺能神经元以开展 体外 疾病建模与药物筛选 体内 帕金森病的细胞移植治疗
引言
多巴胺能（DA）神经元存在于多个脑区，包括中脑、下丘脑、视网膜和嗅球。位于黑质致密部（SNpc）的A9多巴胺能神经元通过向端脑的纹状体投射，形成锥体外系运动系统，从而调控行为和运动。A9多巴胺能神经元的退化会导致帕金森病（PD），帕金森病是人类第二常见的神经退行性疾病，目前尚无法治愈。细胞替代疗法是治疗帕金森病最有前景的策略之一1，因此，人们高度关注从人类多能干细胞（hPSCs）——包括人类胚胎干细胞（hESCs）和近年来出现的人类诱导多能干细胞（hiPSCs）——中获得A9多巴胺能神经元。
大量研究尝试利用不同方法从人多能干细胞（hPSCs）诱导生成A9型多巴胺能神经元。早期所有报道均通过神经玫瑰花结前体阶段来产生多巴胺能神经元。通过与MS5共培养2 或 PA63-5 在有或无外源生长因子的条件下培养2-4周后，L. Studer 及其同事与其他三个研究团队成功诱导人胚胎干细胞（hESCs）形成神经玫瑰花结。随后，他们通过机械分离或酶消化方法富集这些玫瑰花结，以进行进一步分化。在其他研究中，研究人员通过拟胚体（embryoid body, EB）悬浮培养分化的方式生成神经玫瑰花结。6-9随后，研究人员建立了一种基于单层细胞的分化方法10,11，他们在细胞外基质上接种人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs），并在培养过程中添加不同的生长因子，以诱导....
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方案
1. 培养基的制备
- 通过混合以下成分制备小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）培养基：445 ml DMEM、50 ml 胎牛血清（FBS）和 5 ml 100× 青霉素/氨苄青霉素储备液。过滤除菌后的培养基置于 4 °C 保存，不超过 14 天。
- 通过混合以下成分制备含血清的人多能干细胞（hPSC）培养基：385 ml DMEM/F12、100 ml KnockOut 血清替代物（KSR）、5 ml 100× 非必需氨基酸储备液、5 ml 100× 青霉素/氨苄青霉素储备液、5 ml 100× β-巯基乙醇储备液以及 10 ng/ml bFGF。过滤除菌后的培养基置于 4 °C 保存，不超过 10 天。
- 通过混合以下成分制备无血清 mTeSR1 培养基：400 ml mTeSR1 基础培养基、100 ml 5× 补充剂和 5 ml 100× 青霉素/氨苄青霉素储备液。培养基置于 4 °C 保存，不超过 10 天。
- 制备 10× 胶原酶 IV 储备液：称取 0.5 g 胶原酶 IV 粉末，溶于 50 ml DMEM/F12 中，过滤除菌。分装后于 -20 °C 保存数月。
- 制备 0.1% 明胶溶液：称取 0.5 g 牛皮来源 B 型明胶粉末，溶于去离子水中，经高压灭菌后于室温保存数周。
- 通过混合以下成分制备 KSR 分化培养基：410 ml DMEM、75 ml KSR、5 ml 100× 非必需氨基酸储备液、5 ml....
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结果
分化方案的总体概述见图1。本方案的分化效率取决于起始细胞的状态。因此，必须确保以下三点：首先，在将hPSCs解离为单细胞进行分化之前，应彻底清除所有已分化的克隆；其次，通过将细胞在明胶包被的培养板上孵育30分钟，尽可能耗尽（若非全部）MEF饲养层细胞；第三，将hPSC单细胞以适当的密度接种至Matrigel包被的培养板上。如图2所示，重铺的hPSC单细胞在分化前48小时内以细胞簇形式扩展，培养板中约形成70%的融合度。分化后，这些细胞在短短3-4天内即可达到完全融合，从大约D16-D17开始，融合的细胞层中开始出现空隙，可在这些空隙及细胞层下方观察到轴突/神经突。在D20重铺后，已分化的细胞以小团块形式贴壁并生长。随后5天内，这些团块中会延伸出更为密集且形态完整的轴突/神经突，不同团块之间的轴突/神经突开始形成连接。在长期培养过程中，同一团块内的神经元产生更多的突起，逐渐成熟，并与邻近团块中的神经元建立更多连接。
经过11天的分化后，人多能干细胞（hPSCs）可高效地转化为前脑前体细胞。如图3
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讨论
人类多能干细胞（包括hESCs和hiPSCs）可被诱导分化 体外 以生成我们体内大多数（即使不是全部）类型的细胞，包括多巴胺能神经元，这一点已在先前的研究中得到证实19基于胚胎多巴胺能神经元发育的相关知识20 以及其他实验室已发表的实验方案14,15我们优化了从人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化生成多巴胺能神经元的培养条件。该方案高效、可重复，我们已成功将此处所述的方案应用于H1和H9 hESC系，以及来自帕金森病（PD）患者和健康对照个体的hiPSC系。
在我们的实验方案中，获得高效分化率有三个关键步骤：首先，在定向分化前，细胞中不应存在已分化的hPSC集落。由于hPSC培养过程中常出现向三个胚层自发分化的现象，因此在将hPSC解离为单细胞之前，必须清除这些已分化的集落。其次，应从解离后的hPSC中去除MEF饲养层细胞，因为已有研究表明，MEF细胞可分泌促进自我更新并抑制分化的因子21。为此，将hPSC与MEF细胞混合物在明胶包被的培养板上孵育3.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢Renee Reijo Pera实验室成员在本实验方案开发及本稿件准备过程中提供的帮助。本工作由加州再生医学研究所（CIRM）共享实验室（CL-00518）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 10569-010 | |
| FBS | Life Technologies | 26140 | |
| 青霉素/氨苄青霉素 | Life Technologies | 15140-122 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| KSR | Life Technologies | 10828-028 | |
| 非必需氨基酸 | Life Technologies | 11140-050 | |
| β-巯基乙醇 | Millipore | ES-007-E | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| mTesR1 | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| IV型胶原酶 | Life Technologies | 17104-019 | |
| 明胶 | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| N2添加剂 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27添加剂 | Life Technologies | 17504-044 | |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 生长因子减少型Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Accutase | MP Biomedicals | 1000449 | |
| Thiazovivin | Santa Cruz Biotechnology | sc-361380 | |
| SB431542 | Tocris Bioscience | 1614 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SAG | EMD Millipore | 566660-1MG | |
| Purmorphamine | Santa Cruz Biotechnology | sc-202785 | |
| FGF8b | R&D Systems | 423-F8-025 | |
| CHIR99021 | Cellagen Technology | C2447-2s | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-025 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010 | |
| TGF-β3 | R&D Systems | 243-B3-002 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| 小鼠抗人NESTIN抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | 1/1,000 稀释 |
| 兔抗人OTX2抗体 | Millipore | AB9566 | 1/2,000 稀释 |
| 山羊抗人FOXA2抗体 | R&D Systems | AF2400 | 1/200 稀释 |
| 兔抗人LMX1a抗体 | Millipore | AB10533 | 1/1,000 稀释 |
| 兔抗人TH抗体 | Pel Freez | P40101 | 1/500 稀释 |
| 鸡抗人TH抗体 | Millipore | AB9702 | 1/500 稀释 |
| 小鼠抗人TUJ1抗体 | Covance | MMS-435P | 1/2,000 稀释 |
| 兔抗人GIRK2抗体 | Abcam | ab30738 | 1/300 稀释 |
| 兔抗人Calbindin抗体 | Abcam | ab25085 | 1/400 稀释 |
| 离心机 | Eppendorf | 5804 |
参考文献
- Freed, C. R. Will embryonic stem cells be a useful source of dopamine neurons for transplant into patients with Parkinson's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 1755-1757 (2002).
- Perrier, A. L., et al.
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