本文介绍了一种通过免疫标记从啮齿类动物组织中分离的线粒体，并结合流式细胞术分析来检测和定量线粒体外膜蛋白的方法。该方法可进一步扩展用于评估线粒体亚群的功能特性。
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本文内容
摘要
摘要
检测和监测动物组织中线粒体外膜蛋白组分的方法对于研究线粒体的生理学和病理生理学至关重要。本实验方案描述了一种技术，即从啮齿类动物组织中分离线粒体后，通过免疫标记并利用流式细胞术进行分析。线粒体从啮齿类动物脊髓组织中分离，并经过快速富集步骤以去除髓鞘——这是从神经组织制备线粒体组分时的主要污染物。分离后的线粒体随后用目标一抗及荧光标记的二抗进行标记。通过流式细胞术分析，首先使用线粒体特异性染料染色以验证线粒体制剂的相对纯度，继而检测和定量免疫标记的蛋白。该技术快速、可定量且通量高，可对每份样品中的数十万个线粒体进行分析。该方法适用于在正常生理条件下评估线粒体表面的新蛋白，也可用于研究在病理状态下可能错误定位至该细胞器的蛋白。重要的是，该方法可与荧光指示染料联用，以报告线粒体亚群的某些功能活性，且适用于中枢神经系统（脑和脊髓）以及肝脏来源的线粒体。
引言
线粒体是高度动态的细胞器，会经历多轮分裂和融合，可被运输至能量需求较高的部位，并能快速响应生理刺激1。由于人们日益认识到不同组织甚至不同细胞区域内的线粒体具有不同的功能特征，因此需要开发新方法来鉴定这些不同的线粒体亚群。
显微镜技术提供了一种可视化单个线粒体的方法，并可通过免疫荧光确定蛋白质是否存在于线粒体上或线粒体内部2。然而，该方法的定量分析工作量较大，更适用于使用永生化细胞系或原代细胞系的实验。从组织中分离的单个线粒体的研究则显著困难得多，且大多数方法无法在评估线粒体功能的同时方便地鉴定线粒体亚群3。
为克服这一难题，已开发出一种新方法，可用于对从啮齿类动物组织中分离的线粒体进行免疫标记，并通过流式细胞术进行后续分析。该方法能够快速检测和定量定位于线粒体外膜的蛋白质，与显微镜分析相比，该方法劳动强度显著降低，并可在单个样本中分析成千上万的线粒体。该检测方法可用于监测线粒体外膜蛋白的命运及其相对含量，这些蛋白被认为在生理状态下持续存在于线粒体中，也可用于检测蛋白向线粒体表面的募集，或在病理条件下检测错误定位至线粒体的蛋白。此外，结合使用常规荧光指示染料，可同时评估不同线粒体亚群中某些线粒体功能特征。
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方案
本研究中使用的动物均严格按照蒙特利尔大学医院研究中心（CRCHUM）动物保护机构委员会批准的方案（N08001CVsr）进行处理，该委员会遵循加拿大动物护理委员会（CCAC）规定的国家标准。
准备执行本方案所需的所有试剂（表1）。有关仪器、耗材和供应商的其他所有信息均可在材料列表中找到。
表 1. 缓冲液组成。
1. 大鼠脊髓的采集
- 使用 4% 异氟烷对大鼠（Sprague Dawley）进行深度麻醉。通过夹捏前肢无反射反应来确认麻醉效果。采用断头器断头处死大鼠。该处死方法优于其他可能造成脊髓变形的方法。
- 切开背部皮肤以暴露脊柱。使用骨剪在骨盆上方剪断脊柱，观....
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结果
源自大鼠脊髓的线粒体可用靶向线粒体外膜融合相关蛋白 Mitofusin2（Mfn2）的抗体进行免疫标记8分离并使用Mfn2特异性抗体及荧光标记的二抗标记线粒体后，通过流式细胞术对线粒体进行分析图1)。数据采集完成后，使用流式细胞术分析软件对样本进行分析，首先在点图上可视化所有采集到的事件（图 2A). 当将细胞事件绘制在前向散射光宽度（W）与面积（A）的散点图中时，可区分双联体与单联体图2B）。一旦选中单细胞，通过FSC/SSC圈定线粒体群体（图2C），并通过将未染色样本与线粒体特异性染料染色样本的直方图叠加，验证线粒体特异性染料染色阳性的事件数量。为确定线粒体相关事件，将门控设于两个峰的交界处（图 2D）。对于脊髓标本制备，通常 >90%的事件对线粒体特异性染料呈阳性。对于其他组织如肝脏，约98%的事件会标记该染料（数据未显示）。在仅选择对线粒体特异性染料呈阳性标记的事件后，通过设置门控（Mfn2）并使用同型对照确定背景标记水平。.......
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讨论
越来越多的证据表明，线粒体在正常生理功能和疾病中均发挥着关键作用。虽然免疫印迹可以确定在特定条件下哪些蛋白质存在于线粒体内或线粒体表面，但该方法仅反映整个线粒体群体的平均状态，无法提供有关线粒体亚群或亚组相对丰度的信息。尽管过去通常认为所有线粒体都是均一的，但目前研究领域日益认识到，细胞内的线粒体在形态和/或功能上存在广泛的异质性10。
荧光显微镜技术确实能够考虑线粒体的异质性。然而，此类数据的定量分析较为耗时费力。此外，该方法更适用于培养细胞的研究，因为线粒体的标记在培养细胞中更容易实现。 体内/原位 由于存在数量过多的线粒体，使得单个细胞器的区分本身非常困难。在大多数免疫细胞化学实验方案中，由于抗体标记需要进行细胞通透化步骤，因此无法同时标记线粒体外膜蛋白并评估线粒体功能。当前方法使用分离的线粒体，因而不需要通透化步骤。此外，单个线粒体的可视化通常只能通过电子显微镜实现，而该技术不适用于线粒体功能的分析。需要指出的是，我们认识到从组织中分离线粒体会导致线粒体网络的破坏，这可能会影响某些线粒体功能。然而，对于经过相似处理方式获得的组织来源的.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Laurie Destroismaisons和Sarah Peyrard提供的出色技术支持，感谢Alexandre Prat博士提供流式细胞仪的使用权限。我们还要感谢Timothy Miller博士在去除制备样品中髓鞘方面所做出的贡献。本研究得到了加拿大卫生研究院（CIHR）神经肌肉研究合作项目、加拿大创新基金会、加拿大肌萎缩侧索硬化症协会、Frick肌萎缩侧索硬化症研究基金会、CHUM基金会以及魁北克健康研究基金会（C.V.V.）的资助。C.V.V.和N.A.均为魁北克健康研究基金会和加拿大卫生研究院新研究者奖获得者。S.P.由加拿大肌萎缩侧索硬化症协会设立的Tim Noël研究生奖学金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 大鼠 | Charles River | 品系编号 400 | 可用于分离实验的成年（9周至18周）雄性或雌性大鼠。大鼠体重因性别和年龄而异（雄性通常为300至500 g，雌性为200至350 g）。 |
| 杜恩斯匀浆器 | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| 微量离心机 | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| 超透明超速离心管 | Beckman Coulter | 344057 | 透明、薄壁 |
| Sorvall 超速离心机 | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 转子及吊桶 | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | 碘克沙醇，密度梯度介质 |
| 无脂肪酸牛血清白蛋白 | Sigma | A8806 | 线粒体实验必须使用无脂肪酸型 |
| 琥珀酸钠二碱六水合物 | Sigma | S9637 | |
| 兔抗线粒体融合蛋白2抗体 | Sigma | M6319 | |
| 兔IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| PE标记的抗兔IgG抗体 | eBioscience | 12-4739-81 | |
| 微量滴定管 | Bio-Rad | 223-9391 | 用于流式细胞术样本采集 |
| MitoTracker Green (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM：激发波长 490 nm / 发射波长 516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM：激发波长 548 nm / 发射波长 574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM：激发波长 540 nm / 发射波长 600 nm |
| 抗霉素A | Sigma | A8874 | |
| LSR II 流式细胞仪 | BD | ||
| BD FACSDiva 软件 | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | 用于数据分析的软件 | |
| BCA 蛋白检测试剂盒 | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | 不推荐使用Bradford法，因其与高浓度SDS不兼容 |
参考文献
- Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. Mitochondrial dynamics in neurodegeneration. Trends Cell Biol. 23, 64-71 (2013).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. J Cell Biol....
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重印与许可
