代谢谱的实时分析离体鼠标肠隐窝类器官培养

Summary

小肠隐窝类器官培养离体提供的组织培养系统，该系统概括隐窝依赖于干细胞和它们的生态位的增长。我们建立了一个方法，以测定在实时在原代小​​鼠隐窝类器官的代谢分布图。我们发现组织体保持了其源定义的生理特性。

Abstract

小肠粘膜表现出组织成两个基本结构的重复架构：绒毛，伸入肠腔和成熟肠细胞，杯状细胞和肠内分泌细胞组成;和隐窝，驻留近端粘膜下层和肌层，窝藏成体干细胞和祖细胞和成熟的帕内特细胞，以及基质和隐窝微环境的免疫细胞。直到最近几年， 在小肠体外研究仅限于从良性或恶性的肿瘤衍生的细胞系，并没有表示的正常肠上皮细胞的生理机能和在它们所在的微环境的影响。在这里，我们展示了从培养C57BL / 6小鼠的原代小鼠小肠隐窝类器官改编自佐藤等人的方法。（2009）。此外，我们目前使用的crypt类器官培养法检测进行实时测量地穴新陈代谢换货基础耗氧量，糖酵解速率，ATP的产生和呼吸的能力。类器官维持他们的源代码中定义的属性，并保留其代谢改编耗氧量和胞外酸化率反映的各个方面。在这个地穴化培养系统实时代谢研究是一个强大的工具来研究隐窝类器官的能量代谢，以及如何通过营养和药物因素的调节。

Introduction

结直肠癌（CRC）是癌症相关死亡在美国的第三大原因。散发性大肠癌- 即后来的生活产生（> 50岁），并没有明确的遗传易感因素-占〜80％ ​​的情况下，随着发病率的长期膳食模式^1,2的强烈影响。这些肿瘤中表现出对依赖性代谢移对氧化糖酵解，被称为Warburg效应，这可能部分地使较高浓度的蜂窝构件和能量可用（通过谷氨酰胺），以允许和也许驱动的肿瘤细胞的增殖^3-5率高。结肠癌的研究以及其他胃肠道癌症，包括小肠肿瘤提供重要的洞察肿瘤形成的原因。调查胃肠器官系统，可协助DET正常的，有利于肿瘤发生和肿瘤发生的国家之间的代谢差异发芽对肿瘤发展的相对风险，以及早期发现肿瘤的。此外，了解生物能量代谢涉及到线粒体呼吸和糖酵解提供基本的深入了解细胞生理学，老化和疾病状态扰乱肠道内环境稳定。生物能学分析技术，细胞外流量分析，可以利用在细胞生长在培养实时^6,7同时评估线粒体呼吸和糖酵解的速度。

直到最近， 在体外研究小肠被限制在由良性或恶性肿瘤^8,9的细胞系，并没有代表正常的肠道上皮细胞的生理和他们所在的微环境的影响。在2009年，Sato 等人 ¹⁰导入离体培养体系生长的三维（3D）的小鼠的肠上皮组织体，或epithelial“微型胆”，适用于实验，诊断和治疗的研究^10,11。此外，隐窝从cal....

Protocol

按照指南中的美国国立卫生研究院实验动物的护理和使用的建议进行研究。该方案经委员会医学爱因斯坦医学院动物实验的伦理。

1.地穴的分离与培养

1. 隔离小肠隐窝：
   1. 从任何感兴趣的小鼠模型中分离出肠腺。安乐死的小鼠用CO _2，随后通过颈脱位。
   2. 打开腹部纵向和补小肠（SI）的用冰冷的磷酸盐缓冲盐水，PBS（-Ca ²⁺ -Mg ^2+）用2×抗生素-抗真菌剂（防反）。快速隔离小肠。
   3. 深入剖析免费使用手术刀肠系膜脂肪。要小心，不要穿透组织 - 在任何时候都保持组织湿润冰冷的PBS。打开INTE斯坦纵向和用冰冷的PBS彻底清洗。
   4. 切小肠分成两部分，并拉平用湿式棉尖，轻轻用预冷却的滑动刮去绒毛。在冰冷的PBS几次大力清洗。
   5. 孵育于20ml的1×PBS每3毫乙二胺四乙酸（EDTA）/0.5毫二硫苏糖醇（DTT），3分钟为组织的非酶分解。
   6. 切割组织成使用于预冷的滑动刀片的小块（2-4毫米）。传输块放入50ml管含有20ml冰冷的PBS中。
   7. 移液器上下轻轻地用10倍的有10毫升无菌一次性吸管。让组织碎片沉淀在重力作用。用移液管去除上清。重复附加三次;确保上清液是明确的。
   8. 加入20毫升的PBS每2mM EDTA的。漩涡孵育在4℃下进行30分钟，并轻轻摇动。
   9. 让组织....

Results

地穴类器官是8月龄C57BL / 6小鼠饲喂建立纯化营养76A（AIN76A）的啮齿动物饲料美国学院。肠隐窝组织体可以生长在培养物从单个隐窝（ 图1A，单红色箭头）长时间。组织体生长出隐窝状结构在18-20天后在培养物（ 图1B，红色箭头）。隐窝传代，每3周和组织体有效回收下列各通道。

海马生物能量的仪器可以在细胞生长在培养的实时同步​​评估线粒体呼吸和糖酵解的速度。我们采用了这种技术来测定隐窝类器官的新陈代谢。与来自于喂养小鼠AIN76A纯化饮食8个月的组织体，我们测量：1，氧的消耗速率， 如图2A中所示的OCR -红线代表在隐窝组织体的氧消耗速率（皮摩尔/分钟），蓝色是第e控制井只用基质胶（凝胶状蛋白混合物）;在图2B所示2.细胞外酸化速率（ECAR） -红线代表在隐窝组织体细胞外酸化速率（MPH /分钟），蓝色是对照孔仅与胶状蛋白质混合物。

Discussion

我们测试的耗氧率（OCR）和隐窝中分离出8个月大的小鼠并生长成组织体在体外的细胞外酸化速率（ECAR）的基础量的测定之后，隐窝代谢物通过增加寡霉素，羰基氰化物评价-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone（FCCP）和鱼藤酮，按顺序。

基底OCR和基底ECAR记录从0 - 29分钟（ 图2A和2B）。在^第 29 ^届分钟，寡霉素（来自端口A）注射到每个孔中（n = 3时，两个隐窝和对照孔）。寡霉素是一种ATP合成酶抑制剂。它是用来防止状态3（磷酸化）呼吸。因此，寡霉素注射导致轻微降低的OCR，由于ATP合成的线粒体封锁，和隐窝切换到糖酵解来满足其对ATP的产生增加ECAR要求。在64 ^个分，FCCP（来回米的B端口）注射到每个孔中。 FCCP是移动的离子载体，输送氢离子穿过线粒体膜，导致快速的能量消耗，而不需要ATP的生成。 OCR增加，由于解耦和ECAR增加，因为隐窝采用糖酵解生成ATP，.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD 基质胶基底膜基质，GFR，不含酚红，不含 LDEV	BD Biosciences 356231
PBS（磷酸盐缓冲盐水），不含镁，不含钙，pH 7.2	Life Technologies	20012-027
Advanced DMEM/F-12 （1x）	Life Technologies	12634-028
Dulbecco′s 改良 Eagle′s 不含葡萄糖、L-谷氨酰胺、酚红、丙酮酸钠和碳酸氢钠的培养基	Sigma-Aldrich	D5030
酚红钠盐	Sigma-Aldrich	P4758	终浓度 15 mg/l 在 DMEM （D5030） 中 - <强>步骤 2.2.2
抗生素 - 抗真菌剂，100x，100 ml	Life Technologies	15240-062	终浓度 1x 或 2x
青霉素-链霉素，liquid	Life Technologies	15140-122	终浓度 1x
Gibco®GlutaMAX™补充	Life Technologies	35050061	终浓度 1x
Gibco®HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸），1 M	Life Technologies	15630-080	最终浓度 10 mM
N-乙酰-L-半胱氨酸，25 g	Sigma-Aldrich	A9165-25G	最终浓度 1 mM
100x N-2 补充剂，液体	Invitrogen	17502-048	最终浓度 1x
50x B-27® 补充剂减去维生素 A，液体	Invitrogen	12587-010	终浓度 1x
重组小鼠 R-Spondin 1， CF， 50 μg	研发D Systems	3474-RS-050	终浓度 500 ng/ml
重组鼠 EGF，100 &μ;g	Peprotech	315-09	终浓度 50 ng/ml
重组鼠 Noggin，20 &μ;g	Peprotech	250-38	终浓度 100 ng/ml
Gibco®L-谷氨酰胺，200 mM	Life Technologies	25030-081	终浓度 2 mM
Gibco® 葡萄糖粉	Life Technologies	15023-021	终浓度 5 mM
Ambion® 0.5 M EDTA（乙二胺四乙酸），pH 8.0	Life Technologies	AM9260G	终浓度 3 mM（step 1.1.5; step 1.1.8
[header]
DTT（二硫苏糖醇），1M	Life Technologies	P2325	最终浓度 3 mM
来自牛血清的白蛋白 （BSA）	Sigma-Aldrich	A2058	0.1% 在 PBS 胎
牛血清 （FBS）	Life Technologies	16000-044	1% 在 PBS
中 Recovery™细胞培养 冻存 培养基	Life Technologies	12648-010
ROCK 抑制剂 （Y-27632）	Sigma-Aldrich	Y0503	终浓度 10 &μ;M
寡霉素	Sigma-Aldrich	O4876	终浓度 1 &μ;M
羰基氰化物-对三氟-甲氧基-苯腙 （FCCP）	Sigma-Aldrich	C2920	终浓度 1 &μ;M
鱼藤酮	Sigma-Aldrich	R8875	终浓度 1 μM
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	221465	PBS XF24 中终浓度 0.1 N
细胞外通量分析仪（XF 分析仪）	Seahorse Bioscience