本文介绍一种基于荧光的引物延伸方法，用于确定细菌转录本的转录起始位点及RNA加工情况 体内 使用自动凝胶测序仪。
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摘要
摘要
基于荧光的引物延伸（FPE）是一种用于确定RNA分子转录起始点或加工位点的分子方法。该方法通过使用特异性荧光标记的引物对目标RNA进行逆转录，随后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析生成的cDNA片段。同时，在凝胶上运行传统的桑格测序反应，以将cDNA片段的末端精确定位到其对应的碱基位置。与5'-RACE（cDNA末端快速扩增）技术不同，后者需要对产物进行克隆并测序多个候选克隆，而引物延伸产生的大量cDNA片段可在一次凝胶电泳中同时被检测。此外，整个实验流程（从逆转录到最终结果分析）可在一天内完成。通过使用荧光标记的引物，可避免使用具有危害性的放射性同位素标记试剂，并且由于产物可在电泳过程中直接检测，处理时间也得以缩短。
在以下实验方案中，我们描述了一种体内荧光引物延伸方法，可可靠且快速地检测RNA的5'端，以推断金黄色葡萄球菌（S. aureus）、大肠杆菌（E. coli）及其他细菌中的转录起始点以及RNA加工位点（例如，由毒素-抗毒素系统组分介导的加工位点）。
引言
引物延伸1是一种分子生物学方法，可用于以单碱基分辨率确定特定RNA分子的5’端。与其他方法（如5’-RACE（cDNA末端快速扩增））相比，该方法的优势在于实验周期短，并且能够轻松分析不同长度RNA分子的混合物。
该方法通过使用特异性的荧光引物对RNA分子进行逆转录反应，生成特定长度的cDNA片段。这些cDNA分子与传统的Sanger测序反应2一同在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，由于使用了荧光标记的引物，可通过荧光检测到cDNA分子。通过与测序梯度标记物比较cDNA片段的长度，从而实现对RNA 5’端的定位作图。
传统上，引物延伸反应结合放射性同位素使用，以在X射线胶片上检测cDNA分子。由于放射性物质存在健康风险、废物处理问题且操作不便，较新的实验方案采用荧光标记结合自动测序仪来检测引物延伸产物，尽管其灵敏度略低。使用荧光标记的引物后，可省去重复的放射性标记步骤，因为荧光引物具有长期稳定性（据我们经验，可稳定保存一年以上）。
本文所述方法采用自动凝胶测序仪，但经过稍加改进后，毛细管测序仪也可用于cDNA的分离与检测3。凝胶分析的并行特性使其能够检测到极微量的RNA切割或加工事件。另一个优势在于该方法具有高分辨率，甚至可以检测到仅一个碱基的末端切割或加工。
关于RNA切割或加工的检测，通常区分两种不同类型的引物延伸。一种情况是在体外（in vitro）使用纯化的RNA和纯化的酶进行酶促处理；另一种情况是在体内（in vivo）完成RNA加工，随后纯化得到加工后的RNA。在这两种情况下，RNA均需进行体外（in vitro）引物延伸反应，但根据RNA来源的不同，该方法分别称为体外（in vitro）或体内（in vivo）引物延伸。在本方案中，我们仅聚焦于体内（in vivo）引物延伸，因其操作简便（无需纯化蛋白质），并可同时确定转录起始位点和加工位点。然而，体外（in vitro）引物延伸的基本设置原理相同，本方案亦可作为其实验设计的起点。
只要细菌种类能够进行高纯度和高得率的核酸制备，本文所示方法便可适用于多种细菌。
我们实验室的研究重点是毒素-抗毒素（TA-）系统的调控范围4,5，该领域广泛使用引物延伸法。TA系统是存在于原核生物基因组中的小型遗传元件，由一种稳定且内源性具有活性的毒性蛋白和一种通常不稳定的蛋白质或RNA抗毒素组成，后者可拮抗毒性作用6,7毒素的活性有时通过抑制复制、细胞壁合成或其他机制发挥作用，但最常见的是通过RNase活性。8,9通常，核糖核酸酶（RNase）的特异性通过多种测试来确定，其中一种方法是引物延伸法。引物延伸反应非常适合此应用，因为可同时分析切割产物与全长片段的混合物，以确定其5’端。使用混合物 体外 和 体内 引物延伸，特异性毒素RNase切割 例如， 序列特异性可以被确定10-13.
图1. 引物延伸实验流程概览。 根据实验需求培养并处理细菌培养物。从细胞中提取总RNA，用DNase I处理以去除残留DNA，并使用靶标特异性的荧光标记DNA引物进行逆转录反应，生成cDNA。同时提取基因组DNA或质粒，并用于进行荧光标记的Sanger测序反应，以便与cDNA片段进行大小比对。将引物延伸产物与Sanger测序产物一同在变性尿素聚丙烯酰胺凝胶上电泳，随后通过自动激光与显微系统进行分析。与cDNA条带对齐的测序碱基即为5’端cDNA的最后一个碱基（蓝色箭头所示）。详见Fekete, et al. 3 请点击此处查看该图的放大版本。
整个引物延伸实验流程的概述见图1。简而言之，首先培养并收集细菌细胞，离心获得菌体沉淀后进行裂解并提取RNA。纯化后的RNA用DNase I处理，以去除可能作为逆转录酶模板的残留DNA分子。将特异性的荧光引物加入RNA中，使其与目标区域杂交，随后进行逆转录反应，生成单链互补DNA（cDNA）。通过使用荧光引物进行传统的Sanger测序，制备测序梯度片段，并与引物延伸产生的cDNA片段一同在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离。通过比较凝胶上的荧光条带，可确定目标转录本的5’端。随后通过序列比对， individually分析转录起始点和加工位点。
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方案
1. 高产量RNA制备
- RNA 提取
注意：引物延伸反应需要较高浓度的总 RNA。通常，离心柱试剂盒无法获得所需的 RNA 量（约 5 - 16 µg，溶于 5 µl 体积中）。因此，建议采用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法进行纯化，具体步骤如下。
注意：苯酚具有致癌性、毒性和腐蚀性。请阅读材料安全数据表，并在通风橱内佩戴适当防护装备操作！- 按实验需求培养或处理细菌细胞（本示例中为 S. aureus 或 E. coli），通过在 4 °C 条件下以 4,600 × g 离心 10 分钟收集细胞。注意：通常我们收集总 OD600 为 20 - 70 的菌体。细胞沉淀可在 -20 °C 下保存数周。
- 将细胞沉淀重悬于 1 ml 酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿溶液中，并转移至含有 0.5 ml 0.1 mm 玻璃锆/二氧化硅珠的 2 ml 螺口管中。
- 使用快速破碎仪或珠磨机在 6.5 m/sec 条件下裂解细胞，每次 30 秒，共进行三轮，每轮之间将样品置于冰上冷却 5 分钟。注意：均质化后的样品可在 -80 °C 下保存数周。
- 在室温孵育裂解液 5 分钟，然后加入 200 µl 氯仿。
- 剧烈振荡或涡旋样品 30 秒以提取 RNA。
- 室温孵育 3 分钟后，在 4 °C 条件下以 13,000 - 15,000 × g 离心 15 分钟。注意：溶剂将分为下层有机相（粉红色，含蛋白质）、中间相（白色，含 DNA）和上层水相（澄清，含 RNA）。
注意：从此步骤开始，请仅使用无 RNase 的试剂和塑料器皿！ - 准备新鲜的无 RNase 1.5 ml 离心管，做好标记，每管加入约 500 µl 100% 无 RNase 的异丙醇（体积应与前一管中水相体积大致相同）。
- 倾斜离心管，使用无 RNase 的吸头将上层水相（约 500 µl）转移至已准备好的离心管中。注意不要扰动中间相。
- 通过反复倒置混匀数次，并在室温孵育 10 分钟，使 RNA 沉淀。
- 在 4 °C 条件下以 13,000 - 15,000 × g 离心 15 分钟，用移液器或抽吸法（水射流泵配合接收瓶）去除上清液。注意不要扰动底部白色透明的 RNA 沉淀。
- 加入 1 ml 70-80% 无 RNase 的乙醇（不要涡旋）进行洗涤。注意：乙醇中的 RNA 可在 -20 °C 下保存数周。
- 在 4 °C 条件下以 7,500 × g 离心 5 分钟，用移液器或更优的抽吸法弃去上清液。
- 在通风橱中将 RNA 沉淀风干 15 - 30 分钟。切勿过度干燥，否则沉淀可能难以重新溶解。
- 将沉淀重悬于 50 µl 无 RNase 的 ddH2O 或 RNA 储存缓冲液中。
- 使用微量紫外-可见分光光度计或石英比色皿（及常规分光光度计）测定 RNA 浓度，并立即进行 DNase I 消化处理。
- DNase I 消化去除 RNA 中残留的 DNA
注意：由于 DNA 可能在逆转录（引物延伸）反应中作为非特异性模板，因此应从样品中去除。目前有多种方法可用于从 RNA 溶液中去除 DNA，通常依赖于 DNase 消化。以下介绍一种简单、高效且成本较低的 DNA 去除方法。- 将水浴锅预热至 37 °C。
- 在 1.5 ml 反应管中混合表 1 所列的各组分。
- 在 37 °C 水浴中孵育 1 小时，随后直接进行苯酚/氯仿抽提。注意：不建议通过加热使 DNase I 失活，因为这可能导致 RNA 降解。
- DNase I 消化后 RNA 的苯酚/氯仿抽提
注意：必须对 RNA 进行纯化，以去除 DNase I 消化过程中残留的游离核苷酸、DNA 片段和缓冲液成分。苯酚/氯仿抽提法可实现较高的 RNA 回收率和浓缩效果，因此推荐如下。若其他 RNA 纯化方法满足上述要求，也可使用。- 将 500 µl DNase I 消化混合物分装至两个 2 ml 反应管中，每管 250 µl。
- 加入等体积（250 µl）的酸性 P/C/I 溶液（水饱和苯酚、氯仿和异戊醇，比例为 25:24:1，pH 4.5 - 5）。
注意：P/C/I 溶液具有致癌性、毒性和腐蚀性。请阅读材料安全数据表，并在通风橱内佩戴适当防护装备操作！ - 剧烈涡旋或置于涡旋振荡平台上振荡 1 - 3 分钟。
- 在 4 °C 条件下以 13,000 - 15,000 × g 离心 30 分钟。
- 收集上层（水相），转移至新的离心管中（250 µl）。
- 加入 1/9 体积（28 µl）的 3 M 乙酸钠（pH 5.2）。
- 加入 2.5-3 倍体积的纯乙醇（700 µl）。
- 短暂涡旋混匀后，置于 -80 °C 冰箱 30 分钟，或 -20 °C 冰箱 2 - 3 小时。如需，可将 RNA 在 -20 °C 过夜保存。
- 在 4 °C 条件下以 13,000 - 15,000 × g 离心 30 - 60 分钟。
- 用移液器或抽吸法去除上清液。
- 加入 1 ml 70% 乙醇洗涤沉淀。切勿涡旋样品。
- 在 4 °C 条件下以 13,000 - 15,000 × g 离心 5 分钟。
- 用移液器或抽吸法去除上清液。
- 在通风橱中将沉淀风干。如需，可将沉淀在 -20 °C 过夜保存。
- 加入 30 µl DEPC 处理的 H2O，涡旋 2 分钟以溶解沉淀，并用此溶液溶解对应第二个管的沉淀（每对提取样品使用 30 µl 溶液）。
- 测定 RNA 浓度，并确保其超过 1 µg/µl，以适用于中等表达水平 mRNA 的引物延伸实验。
- 如需，RNA 可在 -20 °C 保存数周至数月。
2. 引物延伸反应
- 引物设计
注意：设计引物延伸实验的引物时，应遵循PCR引物设计的一般原则（详见自动凝胶测序仪附带的手册以及本文的讨论部分）。- 具体而言，确保引物（i）不含连续的碱基序列，（ii）在3’端具有G或C，（iii）具有平衡的GC:AT比例，（iv）退火温度约为55–60 °C，以及（v）结合位点位于目标区域下游至少50 bp处，最好为100 bp，以获得清晰的图像。
- 引物延伸反应
注意：引物延伸反应（cDNA合成）需要大量模板RNA。若使用的RNA量过少，信号可能过低而无法检测！因此，我们建议按照上述方法进行RNA纯化。
注意：警告：请使用无RNase的试剂和塑料器皿！！！- 将热循环仪预热至95 °C，并在热循环仪中进行所有后续孵育步骤，以确保操作简便和结果可重复。
- 针对每个RNA样本，将表2中的组分在PCR管中混合。
- 在95 °C下变性样品1分钟。
- 将PCR管置于冰上，冷却5分钟，以促进RNA与引物的杂交。
- 将PCR仪温度设定为47 °C。
- 在此期间，按照表3所述配制逆转录预混液。
- 向每个已杂交的RNA样本中加入4 µl逆转录预混液。
- 在47 °C下孵育1小时。注意：AMV逆转录酶的最适温度为42 °C，但较高温度有助于克服RNA分子的二级结构。
- 将样品加热至95 °C并维持2分钟，以终止反应。
注意：甲酰胺具有腐蚀性、毒性，且可能对胎儿有害。请阅读材料安全数据表，小心操作并佩戴适当的防护装备！ - 加入6 µl甲酰胺上样染料（95% (v/v) 去离子甲酰胺，10 mM EDTA，0.05% (w/v) 溴酚蓝），避光保存于-20 °C，可保存过夜至两周。
3. 测序阶梯的制备
注意：测序反应需要中等量的质粒或高量的基因组DNA。在可能的情况下，建议在测序反应中使用质粒，因为其易于分离且信号强度高。在其他情况下，我们常规采用Marmur5,14的方法，从大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）细胞中提取基因组DNA，而无需使用苯酚。原则上，任何能够获得高产量和高纯度基因组DNA的方法均可使用。
- 基因组 DNA 提取
- 在 LB、BM5 或 TSB 培养基中过夜培养 10 ml 的 E. coli 或 S. aureus 菌液。
- 将菌液于 4,600 × g 离心 10 分钟，使用 15 ml 离心管收集菌体。
- 用 2 ml 某些小型提取试剂盒中的 P1 缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.0，10 mM EDTA，100 μg/ml RNase A）重悬菌体沉淀。
- 加入 20 - 40 µl 溶葡萄球菌酶（浓度 0.5 mg/ml，-20 °C 保存）裂解细胞，孵育 45 - 60 分钟。注意：对于 E. coli 菌体，可省略酶预处理步骤，或使用溶菌酶替代。
- 向悬浮液中加入 100 µl 饱和 SDS 溶液（溶于 45% 乙醇中），37 °C 孵育 5 分钟。
- 加入 650 µl 5 M NaClO4，短暂涡旋混匀。
注意：氯仿具有潜在致癌性。请阅读材料安全数据表，并在通风橱中佩戴适当防护装备下操作！！！ - 向混合物中加入 3 ml 氯仿/异戊醇（24:1）溶液，剧烈振荡至少 60 秒。注意：液体应形成均匀的白色乳状液。
- 将样品于 4,600 × g 室温离心 10 分钟，以分离两相。
- 小心转移上层澄清的水相至新的离心管中。若溶液浑浊，需重复氯仿/异戊醇抽提步骤。测量 DNA 溶液体积，并在新管中加入两倍体积的无水乙醇（100%）。
- 缓慢倾倒或用移液器将 DNA 溶液加入含乙醇的离心管中。注意：DNA 应以透明致密的卷曲状沉淀于管底，或完全脱水后形成漂浮的白色团块。
- 使用玻璃巴斯德移液管制成的钩子取出 DNA 沉淀（图 2），并将每个样品在 1 ml 70% 乙醇中分别浸洗两次。
- 将带沉淀的钩子垂直置于支架上，室温空气中干燥 60 分钟。如有需要，可将干燥后的 DNA 在室温下保存数天。
- 将附着 DNA 的玻璃钩剪下，放入含有 100 - 500 µl ddH2O 的 2.0 ml 反应管中，溶解 DNA。调整体积使最终 DNA 浓度达到 1,000 - 1,500 ng/µl。每轮测序反应需使用 10 - 18 µg 基因组 DNA。
图 2. 制作DNA钓鱼竿的操作说明。将玻璃巴斯德吸管的尖端置于本生灯火焰中，数秒后玻璃开始熔化，在末端形成一个小钩。迅速从火焰中取出，静置冷却1分钟。
- 质粒提取
- 使用标准的质粒小提试剂盒制备质粒，并溶于洗脱缓冲液（10 mM Tris-Cl，pH 8.5）中。根据质粒大小，每个测序反应体系使用100 - 500 ng质粒。
- Sanger测序反应
注意：以下是一个简单的实验方案，使用带有荧光标记引物并含有7-脱氮-dGTP的测序试剂盒，适用于引物延伸实验。详细信息请参考测序试剂盒说明书。请注意，测序反应必须使用与引物延伸反应相同的引物，以确保产生相同长度的产物。- 将12 µl基因组DNA（约10 - 15 µg）与1 µl DMSO和1 µl荧光标记引物（2 pmol/µl）混合。
- 向四种测序反应混合物（A、C、G或T）中的每1 µl中加入3 µl DNA/DMSO/引物混合液。
- 将样品放入PCR仪中，运行以下PCR程序：95 °C预变性2分钟；35个循环（95 °C变性20秒，54 °C退火20秒，70 °C延伸30秒）；最后在4 °C长期保存。
- 反应结束后，从仪器中取出样品，加入6 µl上样染料，短期可置于冰上保存，或在-20 °C保存数天至数周。
4. 凝胶装置设置与电泳仪运行
注意：测序凝胶装置的组装方法、凝胶的制备以及凝胶电泳的操作步骤详见制造商提供的说明书。
- 准备工作
- 按照 表4 中的说明配制10×TBE溶液。
- 在进行凝胶电泳当天，用超纯去离子水（ddH2O）配制1 L的1×TBE缓冲液。
- 配制10%（w/v）的过硫酸铵（APS）。注意：可分装为200 µl小份，在-20 °C下保存数月，但其活性可能随时间推移而降低。
- 凝胶制备装置的组装
- 避免玻璃板之间有灰尘和纤维。因此，应使用湿巾彻底清洁工作台面。
- 使用一次性纸巾和蒸馏水清洁一对25 cm的玻璃板两面，然后用异丙醇擦拭玻璃板内侧。
- 将0.25 mm的间隔条置于后侧玻璃板上，再将带缺口的玻璃板从上方盖下（图3）。
- 将凝胶边条安装在玻璃板两侧，使带缺口的一端和导轨入口导向朝上，并轻轻拧紧旋钮。
图3. 凝胶电泳玻璃板的分解示意图。 玻璃板应按方向使用。注意将玻璃板的内侧朝内放置，外侧朝外放置。
图4. 组装完成的凝胶装置示意图。 注入凝胶溶液后，将样品孔垫片置于两块玻璃板之间的溶液中。随后将制胶板插入前玻璃板与凝胶导轨之间，并通过拧紧导轨旋钮固定。
- 制备凝胶
注意：未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性！请阅读材料安全数据表，并在适当防护条件下使用！！！- 将表5中列出的化合物加入烧杯中，使用搅拌子和磁力搅拌器进行混合。
- 加入APS和TEMED后，立即用50 ml注射器吸取胶溶液，并在针头处安装0.45 nm滤器。
- 用一只手握住玻璃板的上边缘，或将凝胶夹心装置置于凝胶灌注架上，形成一个10 - 20°.
- 缓慢将凝胶溶液注入玻璃板之间，同时持续移动移液器尖端从一侧到另一侧，当凝胶溶液到达底部时停止加样。
- 使用去泡钩将形成的气泡移至旁边或彻底清除。
- 将凝胶垫片（0.25 mm）插入带缺口端的玻璃板之间，浸入凝胶溶液中，并通过连接制胶板固定。
- 轻轻拧紧上部导轨螺丝（参见 图4 （适用于完全组装的装置）。
- 让凝胶静置 1 - 2 小时。
- 移除浇注板和凹槽垫片，并清除凹槽内的盐和凝胶残留物。
- 用ddH₂O冲洗2O，并用纸巾吸去多余的溶液。
- 运行并观察凝胶
注意：测序凝胶直接在凝胶成像仪中进行电泳，同时由激光显微镜同步检测荧光信号。与传统的凝胶电泳方法（先电泳，再染色并成像）不同，该系统的检测单元固定不动，在条带通过激光时实时扫描。以下概述了在OS/2系统上使用ImagIR数据采集软件的操作流程，该流程可适用于更新的软件版本。更多详细信息请参见用户手册。- 将缓冲液槽支架滑入前玻璃板的凝胶导轨中，并拧紧旋钮。
- 将凝胶放入自动凝胶成像仪的下层凝胶槽中，紧贴加热板，并通过将导轨入口导向器滑入仪器支架进行固定。
- 将1×TBE缓冲液加入上下胶缓冲液室中，封闭下层缓冲液室，并使用电源线将上层缓冲液室连接至电源。
- 若存在盐残留，通过反复用移液器将缓冲液吹入胶孔来清洗胶孔。
- 使用上缓冲液盖关闭上缓冲液槽室。
- 关闭仪器门，打开成像仪和计算机，启动 Base ImagIR 数据采集软件。
- 创建一个新的项目文件（文件->新……），输入项目文件名，选择适当的激光范围（700 或 800 nm），然后确认 好的。
- 选择选项->自动增益……从顶部图像菜单中，点击“自动”以开始自动增益测量，然后点击“确定”接受设置。
- 通过选择“选项”来聚焦激光->从扫描仪控制菜单中选择“对焦…”，点击“自动”按钮，然后单击“确定”接受设置。
- 重复自动增益步骤，以调整至新聚焦的区域。
- 根据以下参数设置扫描仪控制：2,000 V，35 mA，45 W， 45 °C扫描滤镜：3，扫描速度：3
- 预电泳空胶 20 分钟（打开电压开关并按下） <输入>).
- 同时，在PCR仪中将测序梯度产物和引物延伸产物加热2分钟 90 °C，然后在冰上冷却。
- 停止电泳，打开自动凝胶测序仪，移除上层缓冲液槽的盖子。
- 将鲨鱼齿梳插入两块玻璃板之间，并用鲨鱼齿轻轻刺破凝胶（参见 图5).
图 5. 带有鲨齿梳的凝胶局部放大图。 样品（紫色）加样于鲨齿之间。
- 将1 - 2 µl的引物延伸产物或测序梯度反应液加入每个凝胶孔（由鲨齿形成）中。
- 如果不需要使用所有孔位，请用上样染料填充空孔，以防止电泳运行不一致。
- 关闭凝胶测序仪的缓冲液槽盖和门。
- 启动电泳并打开激光（选择电压开启和激光开启，然后按 ）。
- 当目标区域通过激光后，停止电泳。
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结果
如图6所示，可通过引物延伸反应确定目标转录本的转录起始位点，并有助于推断启动子区域（通常由-10和-35元件识别）。最上方（最长）的cDNA片段代表mRNA的5’端，因此在与测序梯度标记比较时可轻松定位。
图6. 引物延伸反应的代表性结果左侧为完整 体内 引物延伸凝胶来自 E. coli 使用不同质粒的结果如图所示。感兴趣区域已放大。上部分 （A），对的测定 ompA 转录起始点被标示。逆转录在m...
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讨论
荧光引物延伸是一种简单快速的方法，用于确定RNA的5’端，既可用于TSP识别，也可用于二级RNA加工的鉴定。由于使用了荧光标记的引物，该反应的设置和运行无需额外的安全防护措施（与放射性标记引物的情况不同）。由于样品通过荧光检测，可在电泳进行过程中实时成像，相比通常使用X光胶片的放射性方法，可实现更快速的分析。
通常，引物延伸反应的质量在很大程度上取决于引物的纯度及其结合能力。如果结合位点选择得距离目标区域过近，可能会产生引物拖尾现象而掩盖信号；而若结合位点距离5’端过远（>300 bp），则可能导致信号微弱。
在合成过程中，荧光染料必须共价连接至定制DNA寡核苷酸的5’端，且该寡核苷酸应通过HPLC纯化，以避免残留盐类对逆转录反应产生干扰。带有适当染料修饰的寡核苷酸（有关兼容染料的更多信息，请参见试剂列表表格）可向大多数寡核苷酸合成公司订购，并应避光保存。遗憾的是，目前我们尚不了解任何可将染料酶促连接至已有寡核苷酸的方法，而放射性标记核苷酸则可实现此类标记。
在此...
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披露
作者声明无任何可能构成利益冲突的事项需要披露。
致谢
感谢Anne Wochele在实验室中的协助，以及Vera Augsburger在自动凝胶测序仪使用方面的帮助。感谢德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）通过“重点计划”SPP1316和SPP1617中的资助项目BE4038/2和BE4038/5提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AMV 逆转录酶（20-25 U/μL）µl) | NEB / Roche | NEB: M0277-T / Roche: 10109118001 | |
| DNase I（RNase-free） | Ambion（Life Technologies） | AM2222 | |
| FastPrep-24 仪器 | MPBio | 116004500 | |
| 荧光标记引物 | Biomers | n/a | 5’ DY-681 修饰 “普通” DNA 寡核苷酸。兼容的染料（如 LICOR IRDye 700/800）也可从其他供应商（如 IDTdna）获得。 |
| Li-Cor 4200 测序仪，含 ImagIR 数据采集软件 | Li-Cor | 产品已停产 | |
| NanoDrop 2000 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 无核酸酶水 | Ambion（Life Technologies） | AM9915G | |
| 质粒小提试剂盒 | QIAGEN | 12125 | |
| RapidGel-XL-40% 浓缩液 | USB | US75863 | |
| RNA储存缓冲液 | Ambion（Life Technologies） | AM7000 | |
| Roti-Aqua-P/C/I | 卡尔·罗斯 | X985.3 | 替代方案： “酸性酚-氯仿，pH 4.5（含IAA，125:24:1）” 来自 Ambion (AM9720) |
| SUPERase•在RNase抑制剂中 | Ambion（Life Technologies） | AM2696 | |
| 含7-脱氮-dGTP的Thermo Sequenase荧光标记引物循环测序试剂盒 | GE Healthcare | RPN2538 | |
| TRIzol试剂 | 生命技术公司 | 15596-026 | |
| 氧化锆/二氧化硅珠 0.1 mm | BioSpec | 11079101z |
参考文献
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