远程缺血预处理：一种在啮齿类动物中的神经保护技术

摘要

远程缺血预处理（RIP）是一种使组织耐受损伤性应激的保护方法。我们已建立了一种通过充气血压计袖带5-10分钟对后肢实施远程缺血的方法。在啮齿类动物视网膜变性模型中，已证实RIP具有神经保护作用。

摘要

亚致死性缺血通过上调受损组织内的内源性机制，保护组织免受后续更严重缺血的损害。研究还表明，亚致死性缺血可以上调远端组织的保护机制。在哺乳动物的后肢施加短暂的缺血（5–10 分钟），可诱导大脑、肺、心脏和视网膜产生自我保护反应。这种现象被称为远程缺血预处理（RIP）。这是一种具有治疗前景的保护重要器官的方法，目前已经在心脏和脑损伤的临床试验中应用。本论文展示了一种可控且微创的方法，用于诱导肢体——特别是大鼠后肢——发生缺血。使用专为新生儿设计的血压袖带，连接手动血压计，对后肢上部施加 160 mmHg 的压力。通过使用皮肤温度检测探头记录因压力导致腿部动脉闭塞而引起的皮肤温度下降，以及袖带释放后温度的回升，来验证缺血效果。这种RIP方法可保护大鼠视网膜免受强光引起的损伤和退行性病变。

引言

大多数甚至可能是所有组织在面临代谢应激时，其存活能力可通过预先经历一段亚致死性缺血的条件处理而得到改善^1,2。缺血预处理（IP）在实际操作中是指在组织遭遇更严重的应激（如随后发生的缺血性损伤）之前，先使其暴露于亚致死性缺血状态。在动物模型中，IP对脑、视网膜、心脏和肺具有显著的保护作用^3-6。相应地，对脑卒中患者的研究观察发现，既往短暂性脑缺血发作与更好的临床预后之间存在关联^7,8。IP还能保护视网膜光感受器免受非缺血性损伤⁹。

IP在多种组织和损伤中的有效性表明，它激活了一种存在于所有组织中的细胞存活内在机制。心肌缺血预处理被认为可通过上调缺氧诱导因子（HIF）产生保护作用，HIF已知可通过腺苷释放或线粒体ATP敏感性钾通道的开放来调控多种代谢通路^10,11。腺苷释放和ATP敏感性钾通道也参与脑缺血过程，但迄今为止，针对缺血适应神经保护机制的研究主要集中在抗兴奋性毒性、抗凋亡和抗炎通路的调节上^12,13。总体而言，目前对缺血适应保护神经元的分子机制仍了解有限。

远程缺血预处理旨在通过在非关键组织中诱发缺血，来保护远端的重要器官（如心脏、脑、肺）。已有研究表明，在脑卒中动物模型中，利用后肢进行远程缺血预处理（RIP）具有神经保护作用^14-17。我们所描述的方法提供了一种....

方案

伦理声明：本实验方案遵循悉尼大学动物护理指南（AEC #5657）。麻醉程序已获得动物伦理委员会批准（悉尼大学，AEC #5657）。

1. 仪器设备准备

1. 使用实时皮肤温度监测。打开计算机和数据采集硬件。
2. 启动温度记录软件，将温度设定范围调整为 30–35 °C，采样频率设为每 100 毫秒一次。
3. 可选：插入直肠温度计，以确保核心体温稳定在 37.5 °C。

2. 手动血压计的校准

1. 将新生儿臂套连接到血压计。对于体重为250-550 g的大鼠，使用2号袖带。可能需要适配器将袖带管路连接至血压计。
2. 通过松开排气阀或将袖带管路从适配器上断开，使袖带放气。确保管路中无残留压力，且压力计指针位于椭圆形/矩形区域内的零刻度位置。
3. 检查管路、压力计和袖带之间的压力连接。通过轻轻挤压充气球囊对袖带充气，直至压力计显示100 mmHg。确保压力保持稳定。通过缓慢打开排气阀使袖带放气。

3. 动物准备

注意：将要接受轻度损伤处理的动物需要在远端缺血前一晚进行暗适应。接受光损伤处理的动物需要暗环境饲养（12小时光照：12小时黑暗循环（5勒克斯））

1. 在清醒....

结果

将血压袖带压力升高至160 mmHg以上可阻断后肢血流，如图1B所示。组织缺氧导致动物足部温度下降，用于缺血-再灌注实验方案（图2）。足部温度（33 °C）低于核心体温，在袖带加压期间稳定下降（31 °C），袖带放气后回升（32 °C）。对光照敏感的白化大鼠，无论是否接受远程缺血预处理，均给予一次1,000 lux的光照损伤。通过视网膜电图（ERG）记录并评估视网膜功能。

视网膜电图（ERG）是由视网膜内层和外层神经元对光刺激产生的电反应总和，如图3所示。ERG波形包含一个早期负向波峰，源于光转导过程（光闪后约10毫秒达到最低点），称为a波；以及一个来自视网膜内层的较大正向波峰（光闪后约80毫秒达到最高点），称为b波。正常暗适应的弱光饲养大鼠在受到2.0 log cd·s·m^-2强光闪光刺激时，显示出明显的感光细胞和视网膜内层反应（图3A）。光损伤后一周，与对照组相比，ERG记录显示波幅显著降低，反映出感光细胞的丧失；见

讨论

使用手动血压计和袖带成功诱导了啮齿类动物后肢缺血，并对视网膜感光细胞提供了神经保护作用。该结果与缺血预处理可保护感光细胞免受光损伤的发现一致^9,28。

本质上，远程缺血会导致组织短暂缺氧。因此，远程缺血预处理与缺血预适应（也称为缺血耐受、低氧预处理）在许多方面具有相似性，某种程度上也类似于无氧运动。细胞在应对缺血刺激时，会释放大量蛋白质、核苷以及转录因子，这些物质可直接提供神经保护作用，或促使细胞对后续的代谢应激产生耐受性¹³。

文献中报道的远程缺血干预方案包含多种不同的持续时间与频率。 本实验室已在正常视网膜功能上测试了5分钟、10分钟以及2次×5分钟的缺血方案²⁶。在这些方案中，2次×5分钟的方案在正常大鼠中诱导出最大的ERG振幅变化，因此被选用于光损伤模型中的验证。在人类中，短暂且重复的5分钟缺血事件已被证明可预防复发性中风，在猪的实验性中风模型中也可减小梗死面积^17,22。然而，最适宜的缺血预处理持.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Gold系列DuraShock手动汞柱式血压计	Welch Allyn	DS56	手动血压计
新生儿（2号尺寸）1管装，10个装	Welch Allyn	5082-102-1	肢体血压袖带
鲁尔锁接头	Welch Allyn	5082-178	新生儿袖带适配器
热敏电阻探头模块	AD Instruments	ML 309	皮肤温度测量单元
皮肤温度探头	AD Instruments	MLT 422/A
Powerlab四通道数据采集硬件	AD Instruments	PL 35044
带柔性探头的恒温毯系统	Harvard Apparatus	507222F
毛巾			可选：清醒状态下远程缺血处理
Isoflo - 100% 异氟烷（250 ml）	Abbot Animal Health	05260-05	可选：吸入麻醉下远程缺血处理
Ketamil - 氯胺酮 100 mg/ml（50 ml）	Troy Laboratories Pty Ltd		可选：注射麻醉下远程缺血处理
Xylium - 赛拉嗪 100 mg/ml（50 ml）	Troy Laboratories Pty Ltd		可选：注射麻醉下远程缺血处理