使用开尔文探针力显微镜测量细菌的表面电势

摘要

本文介绍了一种利用开尔文探针力显微镜生成高分辨率纳米级表面电势图谱的实验方案。该技术被应用于评估表面电势对微生物与基底表面结合能力的影响。

摘要

表面电势是一种常被忽视的物理特性，在微生物对基底表面的黏附过程中起主导作用。开尔文探针力显微镜（KPFM）是原子力显微镜（AFM）的一个模块，可测量纳米尺度下表面之间的接触电势差。将KPFM与AFM结合，能够同时生成细菌细胞等生物样品的表面电势图和形貌图。本文中，我们采用KPFM研究表面电势对微生物在医学相关表面（如不锈钢和金）上黏附的影响。表面电势图揭示了不同材料基底上微生物膜表面电势的差异。我们生成了台阶高度图，以显示基底表面与微生物交界区域的表面电势差异。细胞膜表面电势的变化已与细胞代谢和运动性的改变相关联。因此，KPFM是一种强大的工具，可用于研究微生物在黏附至不同基底表面时其细胞膜表面电势的变化。本研究中，我们展示了利用KPFM表征耐甲氧西林Staphylococcus aureus USA100单个细胞在不锈钢和金表面电势的操作流程。

引言

在设备表面和皮肤伤口上形成的生物膜对医疗行业构成了难题，因为生物膜难以清除，可能导致疾病传播率升高以及抗菌素耐药性增强。附着是生物膜形成的第一步，也是最关键的一步，因其具有可逆性^1-3。基底表面特性在微生物附着过程中起着至关重要的作用。表面硬度、孔隙率、粗糙度和疏水性等因素已被证明会影响微生物的附着；然而，关于基底表面电势（SP）对微生物黏附作用的研究仍较少^4,5。带负电荷的表面可阻止苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）芽孢在云母、硅和金表面的附着⁶。细胞膜电位的变化可反映细胞附着能力和运动性的改变^5,7。已有研究发现，电学性质均一的表面更易促进微生物黏附⁵。在纳米尺度上表征细菌的表面电势，可为理解细菌在不同表面上的黏附动力学提供一种新途径，从而有助于抗生物污损策略的开发。与其他用于表征细菌电动力学特性的方法（如激光多普勒电泳、Zeta电位和等电点测定）不同，开尔文探针力显微镜（KPFM）能够对单个细胞进行检测，而非整个菌群^8-11。这在需要高准确度和高精度比较细胞间或生物膜间电学特性时具有显著优势。

开尔文探针力显微镜（KPFM）是原子力显微镜（AFM）的一个模块。AFM 的发展直接源于扫描隧道显微镜（STM）的发明¹²。最早使用 STM 获得的图像由 Gerd Binnig 和....

方案

1. 玻璃器皿和培养物的准备

1. 在进行本实验之前，准备用于培养耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的5%羊血琼脂（SBA）平板。将SBA平板在37 °C下孵育24小时。此后，应出现单个分离良好的菌落，可用于后续接种至液体培养基中。将划线后含有单个菌落的SBA平板在4 °C下保存1至2个月。
   注意：羊血琼脂平板通常以预包装形式提供，每包根据制造商不同包含20至25个平板，其成分为胰蛋白胨大豆琼脂基础培养基，添加5% w/v羊血。
2. 配制500 ml含1%葡萄糖和0.1% NaCl的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）。随后，收集并清洗2支玻璃试管。若试管无可用的可高压灭菌盖子，可用铝箔作为封口。对TSB、试管以及一盒1 ml移液器吸头进行高压灭菌。
3. 在生物安全柜内或靠近本生灯的位置，将5 ml先前已高压灭菌的TSB加入已灭菌的试管中。注意确保有足够时间使TSB和试管冷却至室温。从先前划线的5% SBA平板中，挑取单个菌落接种至6 ml TSB肉汤中。其中一支试管接种MRSA，另一支作为阴性对照，以确保无菌操作。
4. 将接种后的TSB试管置于往复式摇床中，在37 °C、200 rpm条件下孵育24小时。此时，MRSA试管中应可见明显的微生物生长，而对照试管中应无任何生长。
5. 从24小时培养物中取1 ml加入6 ml新鲜TSB中。在37 °C、200 rpm条件下孵育6小时。
6. 将6小时继代培养物1 ml转移至1.5 ml....

结果

利用开尔文探针力显微镜（KPFM）测量表面电势（SP）的能力依赖于样品表面和悬臂探针尖端在一定程度上均具有导电性的原理。不锈钢和金作为导电表面，用于附着耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）。在两种表面上分别采集了15个MRSA细胞的KPFM图像，分辨率为512 × 512，扫描区域范围为5 × 5 µm至10 × 10 µm。扫描时的扫描线速度范围为0.02线/秒至0.05线/秒。因此，每条线采集512个数据点，共需扫描512条线，扫描时间范围为2.84小时至7.11小时。所采集图像的类型见图2。KPFM采用双频率模式工作，因此在获取表面电学特性数据的同时，也同步采集了形貌图像。为更清晰地识别表面电势的微小变化，对SP图应用了热滤波处理（图2）。SP图的数据在图像处理软件分析后，用于确定平均表面电势及其标准偏差。统计分析使用R开源统计编程软件进行，采用学生t检验比较组间差异，以P < 0.05为差异具有统计学意义。

通过分析SP图像以确定微生物膜表面电位，并将其与不同基底表面的生长情况进行比较，旨在探究表面类.......

讨论

开尔文探针力显微镜（KPFM）作为一种获取表面电学数据的新技术被采用。该技术通常用于化学领域中电荷分布的研究，而近年来才开始应用于微米和纳米尺度的生物系统研究。根据所收集的数据，我们发现即使在静态孵育3小时后，微生物似乎也不易附着于洁净的不锈钢和金表面。而经聚-L-赖氨酸功能化的表面在孵育30分钟后即表现出微生物的快速附着。微生物在功能化表面上孵育时间延长会导致样品表面细胞过度密集，从而影响形貌成像质量。表面功能化使不锈钢和金表面的表面电势（SP）由负变正。以往研究表明，由于细胞周围会富集带负电荷的离子以维持渗透压和离子平衡，微生物通常具有负的表面电势²³。此外，已知革兰氏阴性微生物中的磷酸基团以及革兰氏阳性微生物中的磷壁酸会进一步导致负表面电势的形成²⁴。基于对革兰氏阳性与阴性细胞膜基本化学性质的了解，我们曾推测正的基底表面电势将促进微生物的快速附着。然而，如图2 - 4所示，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）细胞在不锈钢和金基底上的表面电势均出现了从正到负的显著转变。微生物的初始附着可能源于细胞膜周围负离子的富集作用。但在清洗细胞并使其在基底表面干燥的过.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5500ILM 原子力显微镜	Agilent Technologies	#N9435S
AFM/STM 金属样品圆盘	TED PELLA, INC.	#16219	不锈钢样品圆盘
DPE（低噪声）导电 SPM 探针	Mikromasch	#HQ:DPE-XSC11	每枚芯片含 4 个铂涂层悬臂梁。实验中使用 B 号悬臂梁。
PELCO 金镀层 AFM/STM 金属样品圆盘	TED PELLA, INC.	#16218-G	金样品圆盘
PicoView 软件	Agilent Technologies	#N9797B	5500ILM 原子力显微镜成像软件
Pico Image 软件（Pico Image Basic）	Agilent Technologies	#N9797AU-1FP	5500 ILM 原子力显微镜图像后处理软件
Scilogex D3024 高速微型离心机	Thomas Scientific	#91201513	用于细胞洗涤步骤中的离心，以分离细胞（沉淀）与培养基
含 5% 羊血的胰蛋白酶大豆琼脂	BD	#221261	预制平板
胰蛋白酶大豆肉汤	BD	#257107	以干粉形式提供。配制方法见容器说明。