快速鉴定化学遗传相互作用 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

摘要

本文介绍了一种在芽殖酵母中定义化学-遗传相互作用的经济高效方法。该方法基于酵母分子生物学的基本技术，非常适合对小到中等规模的化合物库及其他培养环境进行机制性研究。

摘要

确定生物活性化学物质的作用机制是广大学术界、制药界和工业界科学家关注的课题。 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 或称芽殖酵母，是一种模式真核生物，其约6,000个基因的完整基因敲除突变体库以及功能降低的必需基因突变体库均已商业化提供。这些突变体库可用于系统性地检测化学物质与基因之间的相互作用， 即 耐受某种化学物质所必需的基因。这些信息反过来揭示了该化合物可能的作用机制。本文描述了一种在出芽酵母中快速鉴定化学-遗传相互作用的实验方案。我们以化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）为例演示该方法，其作用机制已有明确定义。我们的结果表明，在5-FU存在条件下，细胞增殖依赖于细胞核内的TRAMP RNA外切体复合物以及DNA修复酶，这与此前基于微阵列条形码技术的化学遗传学研究结果一致，也符合已知的5-FU对RNA和DNA代谢均产生不利影响的特性。本文还介绍了此类高通量筛选所需的验证实验流程。

引言

模式生物Saccharomyces cerevisiae中可用的遗传工具和资源，使得大规模的功能基因组学研究成为可能，这些研究共同揭示了基因如何以网络形式协同作用，以满足生物系统的需求。这些工具的核心是合作构建了酵母中所有开放阅读框的非必需基因缺失株的完整集合^1,2。一个显著的发现是，在标准实验室条件下以单倍体形式培养时，仅有约20%的酵母基因对生存是必需的。这凸显了细胞通过利用替代的生物学通路来缓冲基因组扰动的能力。 单独存在时可存活、但组合时致死的遗传突变体，提示了相互关联或汇聚的平行生物学通路，从而形成描述生物学功能的遗传相互作用网络。随着对必需基因的条件性 温度敏感型和功能减弱等位基因的开发，该技术已不再局限于非必需基因的研究^3,4。这一概念已被应用于全基因组尺度，生成了一张无偏倚的遗传相互作用图谱，直观展示了参与相似细胞过程的基因如何聚集在一起⁵。

化学扰动遗传网络可模拟基因缺失（图1）⁶。通过将抑制生长的化合物作用于高密度的缺失突变株阵列，筛选对化合物表现出超敏性的菌株，可获得化学-遗传相互作用谱，即识别出维持化合物耐受性所必需的一系列基因。与遗传相互作用类似，大规模化合物库筛选表明，具有相似作用机制的化合物会聚类在一起⁷。因此，通过建立某个化合物的化学-遗传相互作用....

方案

注意：本实验流程的总体步骤如图2所示。

1. 生长抑制剂量的确定

1. 酵母过夜培养物的制备
   注意：本实验方案中使用的酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖培养基（YEPD）为标准配方¹³。
   1. 将 BY4741 (MATahis3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) 菌株在 YEPD 琼脂平板上划线，并于 30 °C 培养 48 小时 ，直至可见菌落形成。
   2. 挑取单菌落接种于无菌培养容器中的 5 ml YEPD 液体培养基中，30 °C 条件下振荡培养过夜。培养液通常在次日早晨达到饱和状态（约 2 × 10⁸ 个细胞/ml）。
2. 含不同化学物浓度的固体琼脂培养基制备
   1. 用适当的溶剂配制待测化学物的多种母液，使其浓度为预期终浓度的 100 倍 。
      注意：有效浓度取决于具体化学物，需通过实验确定。因此建议初始测试时采用较宽的终浓度范围；例如，从低 µM 到高 mM 范围。
   2. 针对每种待测化学物浓度，将 3 ml 融化的 YEPD 琼脂分装至若干无菌试管中，并置于 55 °C 水浴中以防止凝固。
   3. 对每种待测浓度，向融....

结果

为验证该方法，我们按照上述方案对化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）进行了代表性化学遗传相互作用筛选。已知5-FU可干扰胸苷酸合成酶以及DNA和RNA的代谢¹⁸。5-FU的化学遗传相互作用已被广泛研究，并利用酵母条形码微阵列技术，结合杂合子和纯合子缺失菌株文库进行了系统分析^8,19。本文结果表明，通过比较定量突变菌落大小也可获得类似结果。

需要注意的是，本实验所采用的筛选方法利用了非必需单倍体基因敲除文库。此类筛选也可使用二倍体菌株、温度敏感型突变体或功能减弱等位基因进行，从而能够包含必需基因突变体。使用单倍体敲除文库的一个优势在于，由于基因产物完全缺失，使得靶向通路对药物更为敏感。然而，其两个显著缺点是无法研究必需基因的超敏感性，且单倍体文库在多次传代过程中容易产生自发的抑制性突变，这些突变会被逐步筛选出来，从而导致文库质量下降。因此，在阵列的完整性与广度和药物效应敏感性之间存在固有的权衡。在选择最合适的突变体文库时，必须充分考虑这一因素，并根据具体应用需求做出决策。

首先，通过在逐渐.......

讨论

本文概述了一种生成化学-遗传相互作用谱的方法。该方法十分简便：通过比较全基因组基因敲除文库中每个菌株在有无化学物质存在条件下的菌落大小，即可鉴定出所有应对化学损伤所必需的基因。随后，对获得的敏感菌株列表进行注释富集分析，可进一步揭示该化学物质的作用机制。尽管本实验方案已针对酿酒酵母进行了优化，但也可适用于其他阵列式微生物基因敲除文库，例如大肠杆菌（E. coli）Keio文库，后者已成功用于研究数百种细胞扰动^26,27。

在酵母及其他生物中进行化学遗传学分析已有成熟方法。大多数此类研究依赖于竞争性测定，通过微阵列分析或对独特的遗传条形码进行高通量测序来量化混合的缺失突变体。该方法已被证明在生成大规模化合物库的稳健化学遗传学谱方面非常成功。本文所述的方法为少量待测化合物的化学遗传学分析提供了一种有用的替代方案。该检测方法提供了一种简单的读出方式，成本低于高通量测序或微阵列分析，且不受序列偏好性的影响。尽管本方案中描述的实验流程需要使用机器人仪器进行菌落操作，但此类系统正变得越来越经济实惠；此外，也可对方案进行调整，改用手动打点工具，相关示例已包.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酵母提取物	BioBasic	G0961	用于YEPD液体/固体培养基，加入至终浓度1%（w/v）
胰蛋白胨粉末	BD Biosciences	211820	用于YEPD液体/固体培养基，加入至终浓度2%（w/v）
右旋糖	Anachemia	31096-380	用于YEPD液体/固体培养基，加入至终浓度2%（w/v）— 不可高压灭菌。配制20%的储存液，过滤除菌，待培养基高压灭菌后加入。
琼脂A	Bio Basic	FB0010	用于YEPD固体培养基，加入至终浓度2%（w/v）
G418	A.G. Scientific Inc.	G-1033	配制1,000倍储存液，浓度为200 mg/ml，溶于dH2O，过滤除菌。
12孔板	Greiner Bio One	655180
5 ml 培养管	Evergreen Scientific	222-2376-080
10 cm 培养皿	VWR	25384-302
ROTOR HDA	Singer Instruments	ROT-001	高通量微生物阵列点样机器人
PLUSPLATE© 培养皿	Singer Instruments	PLU-001	每盒200个培养皿
384针短针RePad	Singer Instruments	RP-MP-384	每盒1,000个垫片
1536针短针RePad	Singer Instruments	RP-MP-1536	每盒1,000个垫片
替代点样工具：
全自动机器人系统	S&P robotics	http://www.sprobotics.com	提供多种自动化菌落处理机器人及成像系统。
手动点样工具	V&P Scientific	http://www.vp-scientific.com	手持式复制工具及配件。