Summary

Macrofagen Cholesterol Uitputting en het effect daarvan op de Fagocytose van<em> Cryptococcus neoformans</em

Published: December 19, 2014
doi:

Summary

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Abstract

Cryptokokkose is een levensbedreigende infectie veroorzaakt door ziekteverwekkende schimmels van het geslacht Cryptococcus. Infectie gebeurt bij inhalatie van sporen die kunnen repliceren in de diepe long zijn. Fagocytose van Cryptococcus door macrofagen is een van de manieren waarop de ziekte kan verspreiden in het centrale zenuwstelsel dodelijke hersenvliesontsteking veroorzaken. Daarom is onderzoek naar de associatie tussen Cryptococcus en macrofagen is belangrijk voor het begrijpen van de progressie van de infectie. De onderhavige studie beschrijft stap voor stap protocol macrofaag infectiviteit bestuderen door C. neoformans in vitro. Met behulp van dit protocol, wordt de rol van gastheer sterolen op gastheer-pathogeen interacties bestudeerd. Verschillende concentraties van methyl – cyclodextrine (MCD) gebruikt om cholesterol uit muizen reticulum sarcoom macrofaag cellijn J774A.1 afbreken. Cholesterol uitputting werd bevestigd en gekwantificeerd met behulp van zowel een commercieel beschike cholesterol kwantificering kit en dunnelaagchromatografie. Cholesterol uitgeputte cellen geactiveerd met lipopolysaccharide (LPS) en interferon gamma (IFNy) en geïnfecteerd met antilichaam opsonized Cryptococcus neoformans wildtype H99 cellen bij een effector-tot-doel-verhouding van 1: 1. Geïnfecteerde cellen werden gevolgd na 2 uur incubatie met C. neoformans en de fagocytose index werd berekend. Cholesterol depletie resulteerde in een significante vermindering van de fagocytose index. De gepresenteerde protocollen bieden een handige methode om de inleiding van de infectie proces na te bootsen in een laboratoriumomgeving en bestuderen van de rol van gastheer lipidesamenstelling op besmettelijkheid.

Introduction

Fagocytose is een proces waarbij extracellulaire entiteiten worden geïnternaliseerd door gastheercellen. Het is een belangrijk wapen in het arsenaal van het immuunsysteem om te beschermen tegen pathogenen, maar het proces kan vaak worden ondermijnd door pathogenen te zorgen voor internalisatie en verspreidt zich door het lichaam 1. Fagocytose wordt gemedieerd door verschillende signalering gebeurtenissen die de hechting en afblazen via herschikkingen van het cytoskelet gastheercel. 'Professionele fagocyten kunnen herkennen en binden opsoninen op het oppervlak van de pathogeen te signaleren bevestigen van de vorming van lamellipodia die de pathogeen overspoelen en vormen een phagosome 2. Onder de zogenaamde 'professionele' fagocyten zijn macrofagen. Macrofagen zijn zeer gespecialiseerde cellen die het uitvoeren van beschermende functies die onder andere het zoeken naar en het elimineren van ziekteverwekkers, het repareren van beschadigde weefsels, en het bemiddelen ontsteking, het grootste deel vandeze door het proces van fagocytose 1,2.

Cryptococcus neoformans is een species van pathogene gist die een ernstige ziekte bekend als Cryptokokkose veroorzaakt. Cryptococcus sporen worden ingeademd door de gastheer en resulteren in een longinfectie die meestal asymptomatisch. Men denkt dat de blootstelling zeer gangbaar; Een monster van 61 kinderen uit de Pediatric Infectious Diseases Clinic bij het ​​Bronx Lebanon Hospital Center gevonden dat alle ondervraagde antilichamen tegen de cryptococcal polysaccharide glucuronoxylomannan en andere studies hebben aangetoond prevalentie in zowel menselijke immunodeficiëntievirus (HIV) geïnfecteerde en geïnfecteerde volwassenen 3, 4. alveolaire macrofagen zijn de eerste regel van het antwoord op de longinfectie en in de meeste gevallen met succes duidelijk de ziekteverwekker. In immuungecompromitteerde personen (bijvoorbeeld HIV en AIDS patiënten) de gist kan overleven in macrofagen. In dezegevallen kan de macrofagen dienen als een niche voor de replicatie van het pathogeen en kan de verspreiding ervan naar het centrale zenuwstelsel (CZS) wanneer de ziekte wordt fatale 5 vergemakkelijken – 8. Er wordt gedacht dat macrofagen ook de gist kan leveren direct in de hersenvliezen, waardoor de gist de bloedhersenbarrière passeren via de "Trojaans paard" model 3,9 – 11. Het is dus belangrijk om het proces van fagocytose en de factoren die van invloed zijn, vooral in cryptococcal infecties begrijpen.

Vorige werk in andere pathogeen systemen wijzen op cholesterol en rafts gevormd door cholesterol als het hebben een belangrijke rol te spelen in fagocytose 12-15. Cholesterol is de meest voorkomende soorten lipiden in zoogdiercellen en omvat 25 – 50% van de zoogdiercel membraan 16. Gevonden een rol spelen bij het moduleren van Biophysical eigenschappen van membranen door het veranderen van hun starheid 17. Cholesterol en sfingolipiden samen lipiden microdomeinen binnen het membraan bekend als lipide rafts. Lipide rafts zijn gevonden betrokken te zijn bij de vorming van caveolae, alsmede het verschaffen van een geïsoleerd domein voor bepaalde signalering 16-18. Door hun kleine formaat, is het moeilijk om lipide rafts in in vivo. Een handige manier om de rol van lipide rafts bestuderen is hun bestanddelen veranderen. Methyl-β-cyclodextrine (MβCD) een verbinding die is gevonden om cholesterol afbreken van zoogdieren membranen en wordt vaak gebruikt om de rol van rafts 18 bestuderen.

In dit protocol presenteren we een methode om cholesterol uit gastcelmembranen afbreken en kwantificeren van het effect van de uitputting van het vermogen van de gastheercellen fagocyteren C. neoformans in vitro. Deze procedure maakt gebruik van celkweek techniqUES op een onsterfelijk macrofaagachtige cellijn (J774A.1) als model voor infectie. Cholesterol depletie werd bewerkstelligd door blootstelling aan MβCD die een hydrofobe kern specifiek de grootte van sterolen heeft en kan fungeren als een gootsteen voor cholesterol te trekken uit het membraan 19. Cholesterol depletie werd gemeten kwantitatief behulp van een commercieel verkrijgbare kit en kwalitatief toepassing van een gemodificeerde Bligh-Dyer lipide extractie gevolgd door dunnelaagchromatografie (TLC) 20. . Fagocytose werd gemeten door het infecteren van de cellijn met een cultuur van opsonized gist gemengd met een cocktail van interferon-γ en lipopolysaccharide voor het activeren van macrofagen Cryptococcus werd geopsoniseerd met een glucuronoxylomannan (GXM) antilichaam 21-23. Kleuring en microscopie experimenten termijn voor visualisatie van de cellen en de berekening van de fagocytose index van de mate van fagocytose beoordelen. Bij elkaar genomen, dit protocol describes een basismethode dat de wijziging van lipide samenstelling met een fysiologisch proces integreert.

Protocol

1. Cholesterol Uitputting van J774A.1 Cellen met MβCD In een steriele bioveiligheid kast, zaad 10 5 J774A.1 macrofaag-achtige cellen per putje op een 96-well celkweek plaat in 200 pl Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine (P / S). Incubeer bij 37 ° C en 5% CO 2 O / N. Verwijder media uit de celmonolaag en was de cellen tweemaal met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) die is gefilterd en g…

Representative Results

Cholesterol Uitputting Analyse van het supernatans gereserveerd stap 1.3 van het protocol volgens de instructies van de fabrikant in de Amplex Red Cholesterol Assay kit levert een verhoogd cholesterolgehalte in MβCD behandelde monster vergeleken met de 1x PBS controle. Afhankelijk van celtype en MβCD gebruikte concentratie cholesterol depletie kan variëren. Voor J774 behandeld met 10 mM MβCD, werd een afname van ongeveer 50% waargenomen. Uitputting kan worden berekend met waarden verkregen …

Discussion

Bij het ​​werken met dit protocol is het belangrijk om nauwkeurige celtellingen wanneer plating zoogdiercellen en opsoniserende C. verkrijgen neoformans-cellen. Dit minimaliseert de variatie tussen onderzoeken en zeer nauwkeurig 1: 1 tot doel effectorverhouding gedurende de studie. Het is ook kritisch om de timing van de cholesterol uitputting en infectie coördineren voorkomen opsonized gistcellen of behandelde macrofaag cellen uit rusten bij kamertemperatuur tussen de procedures. Periodes lange w…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door NIH subsidies AI56168, AI71142, AI87541 en AI100631 te MDP. Maurizio Del Poeta is Burroughs Wellcome Investigator in Infectieziekten.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Class II type A2 Biosafety Cabinet Labconco 3460009
J774A.1 cell line ATCC TIB-67 Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Gibco 11995-065 Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use
HI Fetal Bovine Serum Performance Plus Gibco 10082-147 Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140-122 Used to suplement DMEM
Isotemp Cell culture incubator Fisher Scientific Model # 3530
96-Well culture dish Corning Inc. Costar 3595
10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BioReagents BP3994 Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.
Methyl-β-Cyclodextrin Sigma Life Science C4555-10G Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10mM and 30mM concentrations
Orbital Shaker Labline
Amplex Red Cholesterol Assay Kit Life Technologies Molecular Probes A12216 All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.
96-Well Black Assay plate Corning Inc. Costar 3603
FilterMax microplate reader Molecular Devices Model F5
TLC Chamber Sigma-Aldrich Z126195-1EA
Chloroform Sigma-Aldrich 650498-4L
Methanol Sigma-Aldrich 34860-2L-R
TLC Paper Whatman 3030917 Cut down to size needed for TLC tank
Fume Hood Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards 
6-Well Plate Corning Inc. Costar 3506
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Cell Scraper Corning Inc. Costar 3010
Hemocytometer  Hausser Scientific 1490
Centrifuge Beckman Coulter Model Alegra x-30R
Votex Mixer Fisher Scientific 12-812
Balance Mettler Toledo Model # MS104S Meaures down to .1 mg
Glass Pasteur Pipette Fisherbrand 13-678-20A
Cholesterol Avanti Polar Lipids 700000
SpeedVac Concentrator Thermo Scientific Model # SPD2010 
Petroleum Ether Fisher Scientific E139-1 
Diethyl Ether Sigma-Aldrich 309966 
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099
TLC Silica Gel 60 with concentrating zone Analytical Chromatograhy Millipore 1.11845.0001
Iodine Chips Sigma-Aldrich 376558-50G
Sulfuric Acid Sigma-Aldrich 320501 
Manganese Chloride Sigma-Aldrich 244589
UVP EC3 Imaging System Ultra-Violet Products Ltd. Use the Vision Works LS software for densitometry analysis
Glass Bottom Confocal Dish MatTek P35G-1.5-10C www.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99) Obtained from Duke University Medical Center
YNB BD 239210 See manufacturer for preparation instructions. Use a Glucose concentration of 20 g/L.
Lipopolysaccharide Sigma L4391-1MG Dissolve in 1x PBS to make 1mg/mL stock. Store at -20 °C.
Interferon gamma Sigma I4777 Dissolve in 1x PBS to make .1 mg/mL stock solution
Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/mL
Giemsa MP Biomedicals 194591 Dissolve .8 g of Giemsa in 25 mL of Glycerol and heat to 60 °C for 1 hour. Add 25 mL of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.
Microscope Zeiss Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images

References

  1. Sarantis, H., Grinstein, S. Subversion of phagocytosis for pathogen survival. Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).
  2. Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton. Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).
  3. Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis. Virulence. 3, 173 (2012).
  4. Abadi, J., Pirofski, L. A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection. The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).
  5. Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice. Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).
  6. Casadevall, A. Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse. The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).
  7. Chrétien, F., et al. Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia. The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).
  8. Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans. The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).
  9. Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans. Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).
  10. García-Rodas, R., Zaragoza, O. Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans. FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).
  11. Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans. Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).
  12. Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin. Immunology And Cell Biology. 81, 415-423 (2003).
  13. Sein, K. K., Aikawa, M. The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol. In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).
  14. Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis. Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).
  15. Tagliari, L., et al. Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In. Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).
  16. Crane, J. M., Tamm, L. K. Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes. Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).
  17. Brown, D. A., London, E. Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes. Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).
  18. Simons, K., Toomre, D. Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).
  19. Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane. The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).
  20. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification). Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  21. Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages. Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).
  22. Deshaw, M., Pirofski, L. A. Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous. In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).
  23. Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice. Frontiers In Microbiology. 3, 187 (2012).
  24. Chaka, W., et al. Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).

Play Video

Cite This Article
Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (94), e52432, doi:10.3791/52432 (2014).

View Video