כולסטרול מקרופאג דלדול והשפעתו על phagocytosis של<em> Neoformans קריפטוקוקוס</em
Summary
In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.
Abstract
Cryptococcosis הוא זיהום מסכן חיים הנגרם על ידי פטריות פתוגניים של הסוג קריפטוקוקוס. זיהום מתרחש על שאיפה של נבגים, אשר מסוגלים לשכפל בריאה העמוקה. Phagocytosis של קריפטוקוקוס על ידי מקרופאגים הוא אחת הדרכים שהמחלה יכולה להתפשט למערכת העצבים המרכזית לגרום meningoencephalitis הקטלני. לכן, מחקר של הקשר בין קריפטוקוקוס ומקרופגים הוא חשוב להבנת ההתפתחות של הזיהום. המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול צעד-אחר-צעד כדי ללמוד infectivity מקרופאג ידי ג neoformans במבחנה. השימוש בפרוטוקול זה, התפקיד של סטרולים מארח על אינטראקציות מארח הפתוגן הוא למד. ריכוזים שונים של מתיל – cyclodextrin (MCD) שמשו לרוקן את הכולסטרול מJ774A.1 שורת תאים העכברי סרקומה הרשתית כמו מקרופאג. כולסטרול הדלדול אושר ולכמת באמצעות שני מסחרי availablערכת דואר כימות כולסטרול וכרומטוגרפיה בשכבה דקה. תאי כולסטרול מדולדל הופעלו באמצעות Lipopolysacharide (LPS) ואינטרפרון גאמא (IFNγ) ונגועים בneoformans קריפטוקוקוס-opsonized נוגדן תאי H99 wild-type ביחס מפעיל ליעד של 1: 1. תאים נגועים היו במעקב אחרי 2 שעות של דגירה עם ג neoformans ומדד phagocytic חושב. כולסטרול דלדול הביא לירידה משמעותית במדד phagocytic. הפרוטוקולים שהוצגו מציעים שיטה נוחה לחקות את תחילת תהליך הזיהום בסביבת מעבדה וללמוד את התפקיד של הרכב שומנים מארח על infectivity.
Introduction
Phagocytosis הוא תהליך שבו גופים תאיים מופנמים על ידי תאי מארח. זהו נשק מרכזי בארסנל של מערכת החיסון להגן מפני פתוגנים, אך התהליך עשוי לעתים קרובות להיות חתר תחת ידי פתוגנים כדי לאפשר להפנמה ולהתפשט בכל הגוף 1. Phagocytosis מתווך על ידי מספר אירועי איתות שיביאו להתקשרות ובליעה באמצעות ארגון מחדש של שלד התא של התא המארח. phagocytes 'המקצועית' מסוגל לזהות ולהיקשר לopsonins על פני השטח של הפולש לאותת להתקשרות והיווצרות lamellipodia, אשר לבלוע את הפתוגן ויוצר phagosome 2. בין phagocytes "המקצועי" שנקרא מקרופאגים. המקרופאגים הם תאים מאוד מיוחדים שיבצעו את התפקידים הגנתיים הכוללים לחפש וביטול גורמי מחלה גורמת, תיקון רקמות שנפגעו, ומתווך דלקת, רובאלה בתהליך של phagocytosis 1,2.
neoformans קריפטוקוקוס הוא מינים של שמרים פתוגניים שגורם למחלה קשה הידועה בשם Cryptococcosis. נבגי קריפטוקוקוס הם נשאפים על ידי המארח ולגרום לדלקת ריאות שהיא בדרך כלל ללא תסמינים. הוא חשב כי החשיפה היא מאוד נפוצה; מדגם של 61 ילדים ממחל זיהומיות בילדי קליניקה במרכז בית החולים בברונקס-לבנון מצאה כי כל שהשתתפו בסקר היו אלה נוגדנים לglucuronoxylomannan פוליסכריד cryptococcal ומחקרים אחרים הראה שכיחות בשני וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) נגוע ומבוגרים נגועים 3, 4. מקרופאגים מכתשיים הם הקו הראשון של תגובה לדלקת ריאות וברוב המקרים בהצלחה ברור הפתוגן. עם זאת, אצל אנשים מדוכאי חיסון (חולים למשל, HIV ואיידס) השמרים הוא מסוגלים לשרוד בתוך מקרופאגים. באלהמקרים, מקרופאגים יכולים לשמש כנישה לשכפול של הפתוגן ועשויים להקל על הפצתו למערכת העצבים המרכזית (CNS) שבו המחלה הופכת קטלנית 5-8. הוא חשב כי מקרופאגים אולי אפילו לספק את השמרים ישירות לתוך קרומי המוח, עוזרים השמרים לחצות את מחסום דם המוח באמצעות המודל "סוס טרויאני" 3,9 – 11. לפיכך, חשוב להבין את התהליך של phagocytosis וגורמים המשפיעים עליו, בעיקר בזיהומי cryptococcal.
העבודה קודמת במערכות פתוגן אחרות מצביעה על רפסודות כולסטרול ושומנים בדם נוצרות על ידי כולסטרול כבעל תפקיד חשוב בphagocytosis 12 – 15. כולסטרול הוא מיני שומנים הנפוצים ביותר בתאי יונקים וכולל 25-50% מקרום התא היונקים 16. זה כבר נמצא לשחק תפקיד בויסות הביופסיהמאפייני hysical של ממברנות על ידי שינוי קשיחותם 17. כולסטרול וsphingolipids יחד יוצרים microdomains שומנים בתוך הקרום הידוע כרפסודות שומנים בדם. רפסודות שומנים בדם נמצאו להיות מעורבת בהיווצרות caveolae, כמו גם מתן תחום מבודד לסוגים מסוימים של איתות 16-18. בשל גודלם הקטן, שקשה ללמוד רפסודות שומנים בגוף חי. דרך שימושית אחד כדי ללמוד את התפקיד של רפסודות שומנים היא לשנות בוחריהם. מתיל-β-cyclodextrin (MβCD) היא תרכובת שנמצאה לרוקן את הכולסטרול מקרומי יונקים ומשמש בדרך כלל כדי ללמוד את התפקיד של רפסודות שומנים 18.
בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה לרוקן את הכולסטרול מקרום תא מארח ולכמת את ההשפעה של הדלדול ביכולתם של תאי המארח לphagocytose ג neoformans במבחנה. הליך זה עושה שימוש בתרבית תאי techniques על מקרופאג הונצח כמו שורת תאים (J774A.1) כמודל לזיהום. כולסטרול דלדול הושג על ידי חשיפה לMβCD, שבו יש ליבה הידרופובי ספציפית לגודל של סטרולים והוא מסוגל לפעול ככיור לכולסטרול לצייר מתוך הקרום 19. כולסטרול דלדול נמדד כמותית באמצעות ערכה זמינה מסחרי ואיכותי באמצעות שאיבת שומנים בליי-דייר שונה ואחריו כרומטוגרפיה שכבה דקה (TLC) 20. . Phagocytosis נמדד על ידי הדבקה של תא הקו עם תרבות של שמרי opsonized מעורבבים עם קוקטייל של אינטרפרון-γ וlipopolysaccharide להפעלת מקרופאגים קריפטוקוקוס היה opsonized באמצעות נוגדן glucuronoxylomannan (GXM) 21 – 23. מכתים וניסויים במיקרוסקופ אפשרו להדמיה של התאים וחישוב מדד phagocytic להעריך את מידת הרס עצמי. יחדיו, ד פרוטוקול זהescribes שיטה בסיסית, המשלבת את שינוי הרכב שומנים בדם עם תהליך פיסיולוגי.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבודה עם פרוטוקול זה חשוב להשיג ספירת תאים מדויקת כאשר ציפוי תאי יונקים וopsonizing ג תאי neoformans. זה ממזער וריאציה בין ניסויים ומבטיח 1 מדויק: יעד 1 יחס מפעיל לאורך כל תקופת המחקר. זה גם קריטי כדי לתאם את התזמון של דלדול הכולסטרול וזיהום כדי למנוע את תאי שמרי opsonized ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH AI56168, AI71142, AI87541 וAI100631 לMDP. מאוריציו Del Poeta הוא בורוז Wellcome חוקר במחלות זיהומיות.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Class II type A2 Biosafety Cabinet | Labconco | 3460009 | |
| J774A.1 cell line | ATCC | TIB-67 | Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
| HI Fetal Bovine Serum Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Used to suplement DMEM |
| Isotemp Cell culture incubator | Fisher Scientific | Model # 3530 | |
| 96-Well culture dish | Corning Inc. Costar | 3595 | |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use. |
| Methyl-β-Cyclodextrin | Sigma Life Science | C4555-10G | Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10mM and 30mM concentrations |
| Orbital Shaker | Labline | ||
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Life Technologies Molecular Probes | A12216 | All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions. |
| 96-Well Black Assay plate | Corning Inc. Costar | 3603 | |
| FilterMax microplate reader | Molecular Devices | Model F5 | |
| TLC Chamber | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
| TLC Paper | Whatman | 3030917 | Cut down to size needed for TLC tank |
| Fume Hood | Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards | ||
| 6-Well Plate | Corning Inc. Costar | 3506 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Cell Scraper | Corning Inc. Costar | 3010 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Model Alegra x-30R | |
| Votex Mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Balance | Mettler Toledo | Model # MS104S Meaures down to .1 mg | |
| Glass Pasteur Pipette | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | Model # SPD2010 | |
| Petroleum Ether | Fisher Scientific | E139-1 | |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 309966 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| TLC Silica Gel 60 with concentrating zone | Analytical Chromatograhy Millipore | 1.11845.0001 | |
| Iodine Chips | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| Manganese Chloride | Sigma-Aldrich | 244589 | |
| UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Use the Vision Works LS software for densitometry analysis | |
| Glass Bottom Confocal Dish | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
| Cryptococcus neoformans (H99) | Obtained from Duke University Medical Center | ||
| YNB | BD | 239210 | See manufacturer for preparation instructions. Use a Glucose concentration of 20 g/L. |
| Lipopolysaccharide | Sigma | L4391-1MG | Dissolve in 1x PBS to make 1mg/mL stock. Store at -20 °C. |
| Interferon gamma | Sigma | I4777 | Dissolve in 1x PBS to make .1 mg/mL stock solution |
| Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) | Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/mL | ||
| Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Dissolve .8 g of Giemsa in 25 mL of Glycerol and heat to 60 °C for 1 hour. Add 25 mL of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month. |
| Microscope | Zeiss | Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images |
References
- Sarantis, H., Grinstein, S. Subversion of phagocytosis for pathogen survival. Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton. Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).
- Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis. Virulence. 3, 173 (2012).
- Abadi, J., Pirofski, L. A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection. The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).
- Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice. Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).
- Casadevall, A. Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse. The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).
- Chrétien, F., et al. Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia. The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).
- Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans. The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).
- Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans. Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).
- García-Rodas, R., Zaragoza, O. Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans. FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).
- Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans. Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).
- Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin. Immunology And Cell Biology. 81, 415-423 (2003).
- Sein, K. K., Aikawa, M. The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol. In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).
- Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis. Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).
- Tagliari, L., et al. Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In. Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).
- Crane, J. M., Tamm, L. K. Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes. Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).
- Brown, D. A., London, E. Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes. Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).
- Simons, K., Toomre, D. Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).
- Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane. The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification). Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages. Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).
- Deshaw, M., Pirofski, L. A. Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous. In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).
- Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice. Frontiers In Microbiology. 3, 187 (2012).
- Chaka, W., et al. Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).
