Les ganglions rachidiens neurones et les cellules souches différenciées dérivées de tissu adipeux: Un<em> In Vitro</em> Co-culture modèle pour étudier la régénération des nerfs périphériques

Summary

Ganglions de la racine dorsale (DRG) sont des structures contenant les neurones sensoriels du système nerveux périphérique. Lorsqu'ils sont dissociés, ils peuvent être co-cultivées avec des cellules souches du tissu adipeux SC-like (ASC), fournissant un modèle précieux pour étudier in vitro la régénération nerveuse et la myélinisation, imitant l'environnement in vivo au site de la lésion.

Abstract

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Introduction

Lésions des nerfs périphériques sont communs avec environ 9000 cas au Royaume-Uni se produisant chaque année dans une population jeune et surtout de travail ^1. Malgré les techniques de réparation nerveuse microchirurgie, la restauration de la fonction normale est inaccessible avec facultés affaiblies entraînant la sensation de la main, la fonction motrice réduite et des douleurs fréquentes et l'intolérance au froid ^2. Ces blessures ont un impact profond et durable sur le patient et leur capacité à effectuer des activités de la vie quotidienne, avec moins de 60% ​​le retour au travail ^3.

Après une lésion, le phénotype et la morphologie des neurones et les cellules de Schwann (SC) de changement afin de créer un environnement approprié pour permettre à la germination de l'axone. En cas de sectionnement, le nerf est divisé en proximale et distale souches; la souche proximale étant le point à partir duquel le processus de régénération a lieu, tandis que le moignon distal subit wallérienne dégénérescence après quoi le détachement de SCdes axones blessés, de-différencier et proliférer. Ce est fondamental vers l'élimination des débris de myéline et la préparation du moignon distal pour ^4,5 nerf re-génération. Axon germination est soutenu par la production de facteurs neurotrophiques et chimiokines publiées par SC au moignon distal, et guidé par la lame basale laissés à la suite Dégénérescence wallérienne ^6,7. SC aligner le long de la régénération de l'axone formant les bandes de Büngner, ce qui facilite la croissance des axones vers l'organe cible, ce qui réduit l'extérieur du tube de ramification endoneurale. Après réinnervation, SC former la nouvelle gaine de myéline enveloppant les axones régénérés, mais la fonction sensorielle et motrice ne est que partiellement restauré ^8.

Ganglions de la racine dorsale (DRG) sont des structures situées dans la trous intervertébraux de la colonne vertébrale, contenant les cellules neuronales sensorielles innervant les organes périphériques. Lorsque dissocié, ils peuvent être utilisés en tant que modificateur approprié in vitroel pour l'étude de la régénération nerveuse ^9-11, y compris les enquêtes de formation de la myéline. En particulier, les neurones de DRG adulte imitent les caractéristiques in vivo de ces cellules et de fournir un formidable outil pour étudier de nouvelles stratégies de réparation des nerfs périphériques dans l'ingénierie tissulaire.

Co-cultures représentent un système dynamique qui simule in vitro de l'interaction de deux (ou plusieurs) types de cellules dans un environnement particulier in vivo. L'un des avantages de ces modèles de co-culture de cellules est la flexibilité et une haute contrôle qui peut être exercée sur l'environnement extracellulaire. Neurones DRG ont été fréquemment utilisés dans les systèmes de co-culture avec SC pour imiter les interactions réelles qui se produisent entre les deux types de cellules dans le système nerveux périphérique ^{10,12 – 14.} Il a été démontré que SC sécréter la matrice extracellulaire (ECM) des protéines et des facteurs de croissance qui peut remarquablement améliorer lacapacité des neurones de DRG de survivre et germer neurites ^15,16. Toutefois, SC nécessite de longues périodes de temps de proliférer et, malgré les progrès de la technique de culture cellulaire, il est encore difficile de générer un nombre approprié de cellules pour les applications d'ingénierie tissulaire. En outre, le sacrifice d'un nerf sain est rendue nécessaire pour récolter SC autologue. Par conséquent, la différence dans l'approvisionnement SC est important à la fois pour l'ingénierie tissulaire et dans les tests in vitro de la régénération nerveuse. Dans cette perspective, l'ASC peut être considéré comme une alternative intéressante pour le développement d'une construction de génie tissulaire à être utilisé pour la réparation nerveuse périphérique ^17,18. Des travaux antérieurs ont démontré la capacité de ces cellules à se différencier en SC-like ASC, exprimant gliales marqueurs caractéristiques, tels que la S-100, p75 et la protéine gliale fibrillaire acide (GFAP) ^19, ainsi que la protéine de myéline zéro (P0) ²⁰ . La sécrétion de facteurs de croissance gliaux, tels que le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), le facteur de croissance des nerfs (NGF) et le facteur neurotrophique dérivé des cellules gliales cellulaire (GDNF) a également été observée ^21,22. Par conséquent, SC-like ASC peut être utilisé en tant que promoteur de la régénération des nerfs périphériques, comme l'a démontré à la fois in vitro et in vivo ^{de 23 à 26.} En outre, l'ASC peut être récolté par des procédures minimalement invasives en nombre plus élevé par rapport à d'autres types de cellules souches; la fréquence des cellules souches dans le tissu adipeux est de 100 à 1000 fois plus élevée que dans la moelle osseuse ^27, et ils ont un taux de prolifération plus élevé par rapport à des cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse et SC.

Ce travail vise à fournir un protocole détaillé pour effectuer les récoltes à haut rendement de neurones DRG dissociés et ASC respectivement, ce dernier étant différenciées en cellules SC-like. La co-culture de ces deux types de cellules sera donc prévoir un système très pratique qui peut être utilisé pour de futures études sur la capacité de ne DRGurons à germer neurites et les mécanismes de formation de la myéline sur échafaudage différente pour l'ingénierie du tissu nerveux.

Protocol

NOTE: Toutes les expériences impliquant des animaux ont été effectuées en conformité avec les animaux au Royaume-Uni (Scientific Procedures) Act, 1986. 1. expérimental Avant de commencer la récolte de tissus et de cellules, vérifier que tous les outils sont stériles. Que nécessaire, autoclave une paire de ciseaux chirurgicaux Sharp, très fines pinces et une pince fine standard. Stériliser également chaque substrat avant l'ensemencement de cellules en utilisant la stérilisation UV, exposition à l'éthanol ou la stérilisation à la vapeur, le cas échéant. Préparation des médias pour la récolte de cellules souches et la différenciation Préparation du milieu de croissance de cellules souches, contenant du milieu essentiel minimum (α-MEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 200 mM de L-glutamine et 1% de pénicilline-streptomycine (PS). Préparer une solution mère 10 mM de forskoline en dissolvant 10 mg de forskoline dans 2,436 ml de sulfoxyde de diméthyle stérile. Utiliser à une concentration finale de 14 uM. </Li> Préparer une solution à 35 ml mg / stock d'acide rétinoïque en dissolvant 50 mg dans 1,43 ml de sulfoxyde de diméthyle stérile. Utilisation à une concentration finale de 350 ng / ml. Préparer le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) des stocks (100 ug / ml) en dissolvant 10 mg de poudre lyophilisée dans 100 pi d'eau distillée stérile. Utilisation à une concentration finale de 5 ng / ml. Préparer facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) des stocks (100 ug / ml) en dissolvant 50 mg de poudre lyophilisée dans 500 pi d'eau distillée stérile. Utilisation à une concentration finale de 10 ng / ml. Préparation du milieu de différenciation de cellules souches, contenant un milieu de croissance de cellules souches supplémenté avec 14 uM de forskoline, 126 ng / ml croissance gliale facteur-2 (GGF-2), 5 ng / mL dérivé des plaquettes facteur de croissance (PDGF), et 10 ng / ml de facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF). Préparation des médias et des solutions d'achat d'actions pour la récolte des neurones et de la dissociation Préparer Bottenstein et (la BS) de Sato support 28, par addition de 1% de PS et 1% de supplément N2 à du milieu F12 de Ham. Calculer le volume final nécessaire que 500 ul par puits (si vous utilisez une plaque de 24 puits). Préparer les stocks collagénase IV dans du milieu F12 de Ham à une concentration de 1,25% p / v. Filtre-stériliser la solution et conserver à -20 ° C en aliquotes de 200 pi. Préparer stocks de trypsine pancréatique bovine dans le milieu F12 de Ham à la concentration de 2,5% en poids / volume, filtre stériliser et conserver à -20 ° C en 200 aliquotes. Préparer le facteur de croissance des nerfs (NGF) solution mère à la concentration de 5 ug / ml dans un filtre stérilisé 1 mg / ml de sérum albumine bovine sans acide gras (BSA) solution en milieu de F12 et conserver à -20 ° C en 200 pi aliquots. Ne pas faire un filtrage du NGF après reconstitution. Dans le cas où aucune modification de surface a été effectué, des lamelles de couches / plaques de poly-D-lysine (0,1 mg / ml pendant 15 min à température ambiante) Et / ou la laminine (2-10 mg / cm 2 pendant 2 heures à 37 ° C) pour soutenir l'attachement neurone et la croissance des neurites, le cas échéant. Toujours réchauffer médias dans un bain d'eau à 37 ° C avant de l'utiliser. 2. adipeux dérivés de cellules souches (ASC) récolte et de la différenciation dans un phénotype SC la récolte de l'ASC de la graisse viscérale et inguinale des rats mâles adultes Sprague-Dawley Avant de commencer, préparer un tube avec 10 à 15 ml de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) additionnée de 1% v / v de solution PS et stocker sur de la glace jusqu'à ce que la graisse récolte. Terminer le rat par dislocation cervicale et décapitation. Raser le rat et faire une incision abdominale à travers la peau, exposant ainsi les organes internes et d'éviter les saignements. Retirer la graisse viscérale enfermant l'estomac et les intestins (le plus souvent caractérisés par une consistance grasse jaune) et la graisse qui entoure les testicules inguinale d'un adulte mâle Sprague-Dawley rats. e de transferte graisse dans le tube contenant HBSS sur de la glace. Dans une enceinte de sécurité biologique (classe II) hacher finement la graisse en utilisant une paire de ciseaux et une lame de rasoir stérile jusqu'à consistance bien est atteint et le transférer dans un tube contenant 15 ml de solution à 0,2% de type I de la collagénase poids / v fraîchement préparé stérilisée par filtration sur la journée. Transférer le tube dans un bain-marie à 37 ° C et laisser le tissu adipeux à digérer en présence de l'enzyme pendant 30 minutes-1 heure sous agitation continue. Surveiller étroitement la digestion et se arrête avant que le tissu soit complètement dissocié, ce qui améliorera la viabilité cellulaire et le rendement de la cellule. Tissus Filtre Theun-dissocié par un tamis cellulaire 100 um. REMARQUE: Bonne digestion du tissu entraînera consistance homogène de la graisse, visible par l'œil quand remuant doucement le tube, acquérir une apparence beige. Neutraliser l'enzyme en ajoutant 15 ml de milieu de croissance des cellules souches contenant du sérum bovin foetal à 37 ° C et la centrifugeusesolution à 160 g pendant 10 min afin de recueillir la fraction stroma vasculaire, y compris les cellules souches, à la partie inférieure du tube. A ce stade, le culot peut être remis en suspension dans 1 ml de globules rouges tampon de lyse pour éliminer la contamination de cellules sanguines. Après remise en suspension et de pipetage pendant 1 minute, ajouter 10 ml de milieu de croissance des cellules souches fraîches et centrifuger à 160 g pendant 10 min. Aspirer soigneusement le surnageant du tube, en prenant soin de la pastille cellulaire déposée au fond. Remettre en suspension les cellules dans 10 ml de milieu de croissance des cellules souches, les transférer dans un flacons de 75 cm2 et incuber à 37 ° C, 5% CO 2. Maintenir les cellules aux niveaux sous-confluentes jusqu'au passage 1-2, changer milieu tous les trois jours. différenciation ASC à un phénotype SC Au passage 1-2, éliminer le milieu de croissance de cellules souches à partir de la 75 cm 2 flacon et le remplacer par 10 ml de milieu frais contenant 1 mM β-mercaptoéthanol fraîchement préparouge et stérilisée par filtration sur la journée. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 24 heures. A ce stade, il est important que les cellules sont ensemencées à faible densité (30%) avant de commencer la différenciation. Laver les cellules soigneusement avec du HBSS, aspirer et de le remplacer par 10 ml de milieu contenant 350 ng / ml d'acide rétinoïque. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 72 heures. Essayez de minimiser l'exposition du milieu cellulaire à la lumière. Après trois jours, laver les cellules soigneusement avec du HBSS, aspirer et de le remplacer par 10 ml de souches milieu de différenciation cellulaire (voir l'étape 1.2.6). Maintenir les cellules au niveau sous-confluentes, changer milieu tous les trois jours. NOTE: Après deux semaines d'incubation, ASC sont différenciées en SC-like ASC, exprimant leur phénotype caractéristique (comme démontré par Kingham et al 5.). Ils peuvent ensuite être utilisés jusqu'à la 10e passage, sans changements notables dans le comportement 29. <p class = "jove_title"> 3. Récolte et de dissociation des ganglions rachidiens (DRG) neurones Terminer le rat par dislocation cervicale et décapitation. Rasez le rat et soulever la peau pour exposer la colonne vertébrale. Avec des ciseaux pointus, Excide la colonne vertébrale en prenant soin supplémentaire des organes confinés et les vaisseaux sanguins. Transférer la colonne vertébrale dans une enceinte de sécurité biologique (classe II) en utilisant une boîte de Pétri et de supprimer toute partie dorsale. Diviser la colonne vertébrale en deux le long de l'axe longitudinal avec des ciseaux chirurgicaux stériles et pointus pour exposer le tissu de cordon. À ce stade, il est utile de couper la colonne vertébrale en deux segments plus petits en dessous du niveau de la cage thoracique, pour le rendre plus facile à manipuler pendant la récolte des neurones DRG. En utilisant des pinces fines, retirez délicatement tout le tissu de la moelle, en accordant une attention à ne pas tirer et enlever les racines DRG. De cette façon, le DRG et les racines seront exposés dans les canaux vertébraux, encore enfermé dans la colonne. Observez DRG sous forme de filaments blancs coming directement à partir des canaux. Retirez toute la racine de DRG (pas seulement le DRG) des canaux vertébrales de l'aide de pinces très fines, aller en profondeur dans les canaux vertébrales et de prêter attention à ne pas endommager les racines des ganglions. Transférer le DRG dans une petite boîte de Pétri (60 mm 2) contenant 3-4 ml de milieu F12 de Ham additionné de 1% PS. Si vous utilisez différents animaux, utiliser des plats séparés. Sous un microscope de dissection, nettoyer le DRG de tout excédent de racines nerveuses entourant les ganglions aide de pinces stériles et un scalpel pour réduire la contamination de cellules gliales. Transférer le DRG dans une petite boîte de Pétri (35 mm 2) avec 1,8 ml de milieu F12 frais. Ajouter 200 ul d'une solution p / v collagénase de type IV de valeurs de 1,25% (concentration finale de 0,125%) et incuber le DRG à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 1 heure. Aspirer soigneusement le milieu avec une pipette en verre, en accordant une attention de ne pas aspirer ou endommager la DRG. Ajouter milieu F12 frais soupleen œuvre avec 0,125% p / v de la collagénase de type IV enzyme et incuber pendant 1 heure comme décrit précédemment. Aspirer le milieu et laver délicatement la DRG avec un milieu de F12. Ajouter ensuite 1,8 ml de milieu F12 et 200 pi de trypsine (concentration finale de 0,25% p / v) et incuber à 37 ° C, 5% de CO2 pendant 30 min. Retirer la trypsine et ajouter 1 ml de milieu F12 supplémenté avec 500 pi de FBS pour arrêter la réaction enzymatique. Aspirer le milieu et laver délicatement la DRG avec un milieu de F12 trois fois pour éliminer les traces de sérum. Ajouter 2 ml de milieu F12 frais et transférer soigneusement le DRG avec le milieu dans un tube de 15 ml en utilisant une pipette en verre. Dissocier doucement les neurones DRG par pipetage de haut en bas (environ 8-10 fois) avec la pipette de verre (embouts en plastique peuvent être utilisés comme solution de rechange). Laisser le pellet se déposer au fond du tube et de recueillir le milieu dans un nouveau tube. Ajouter 2 ml de milieu F12 frais dans le tube contenant le culot et répéter la mdissociation écanique avec la pipette de verre. Répétez cette étape jusqu'à ce que la suspension devienne homogène (environ 3-4 fois) et recueillir toutes les DRG dissocié dans le nouveau tube. Cette méthode réduit la contrainte résultant de la dissociation mécanique et améliore la viabilité des neurones. Filtrer la suspension homogénéisée résultant dans un nouveau tube de 15 ml en utilisant un tamis de 100 um cellulaire pour éliminer les neurones non dissociés et d'autres débris. A ce stade, il peut être commode de premier filtrage de la suspension cellulaire dans un tube de 50 ml, puis transférer la solution dans le tube plus petit en utilisant une pipette en verre. Centrifuger la suspension à 110 g pendant 5 min. Préparer une sérum-albumine bovine à 15% (BSA) en ajoutant 500 ul d'une solution de BSA à 30% à 500 ul de milieu F12. Pipette lentement la solution le long du mur d'un tube de 15 ml pour créer un sentier de protéines progressive. A ce stade, il est utile de tenir le tube à un angle de 45 ° et relâcher lentement l'BSA en utilisant les numéros surle tube de faucon comme une référence pour la "piste" former. Aspirer le surnageant provenant de l'étape 3.10 laissant 500 pi au fond du tube et remettre en suspension le culot de cellules dans le même milieu. Pipette lentement la suspension le long du sentier de protéine préparée précédemment à l'étape 3.11 (utiliser les numéros sur le tube de référence) et centrifuger à 500 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu de BS modifiée (ou un milieu mixte pour l'ASC / DRG co-culture de SC-like, comme décrit ci-dessous à l'étape 4.5. NOTE: Le volume de remettre en suspension les neurones DRG peut être constitué au volume réel nécessaire, en fonction de la concentration cellulaire finale souhaitée et le nombre d'échantillons à ensemencer. Un animal fournira suffisamment de cellules pour une expérience de plaque de 24 puits. Incuber les échantillons ensemencés à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 2 heures pour permettre la fixation des cellules et enfin ajouter du milieu frais additionné de BS à 50 ng / ml de fa de croissance des nerfscteur (NGF). 4. Direct Co-culture de la SC comme ASC et DRG neurones Maintenir SC-ASC comme dans la culture au niveau sous-confluence comme décrit à l'étape 2.2.3. Vingt-quatre heures avant la récolte de DRG, aspirer le milieu de différenciation de cellules souches et laver les cellules avec HBSS. Aspirer et incuber dans 3 ml de trypsine à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 3 minutes. Arrivée au microscope optique que toutes les cellules sont détachées de la fiole. Tapoter légèrement le ballon pour aider détachement. Ajouter 7 ml de milieu pour interrompre la réaction de la trypsine, de recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et centrifuger à 110 g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 ml de milieu de différenciation de cellules souches. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre et on dilue la suspension de cellules en fonction de la concentration finale requise. Idéalement, l'ensemencement 20 000 SC comme ASC / cm 2 garantirait une couche confluente de cellules. Ensemencer le SC-likeASC sur le substrat et incuber à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 24 heures pour permettre la fixation des cellules. Après 24 heures d'incubation, aspirer le milieu et ajouter les neurones de DRG au-dessus des cellules comme décrit dans l'étape 3,14 et 3,15. Changer le milieu à un milieu mixte contenant 50% de milieu de différenciation de cellules souches et 50% de milieu BS. En outre, la réduction de la concentration de FBS à 1-2,5% dans le milieu mixte finale permet d'éviter la prolifération de contaminer les cellules satellites provenant de la dissociation de DRG. Incuber les échantillons de co-culture à 37 ° C, 5% CO 2 et de maintenir en culture pendant le temps nécessaire pour les essais futurs.

Representative Results

Les cultures de neurones de DRG dissociés représentent un modèle adapté à vitro pour l'étude de la régénération nerveuse. Cependant, les substrats non traités ne prévoient pas un environnement approprié pour la fixation de DRG et l'extension des neurites. SC-like ASC sont capables de produire des facteurs de croissance et des chimiokines 19 qui peuvent améliorer la capacité des neurones de DRG à germer neurites quand ils sont libérés dans le milieu de culture. La présence de SC-ASC comme dans le système de culture peut donc jouer un rôle important dans la régulation des fonctions de DRG. Ce protocole (Figure 1) illustre la procédure à effectuer une co-culture directe des ASC et DRG neurones SC-like, au cours de laquelle les cellules neuronales se mettent en contact direct avec déjà ensemencé ASC SC-like. La principale difficulté associée à cette procédure est la grande variabilité du nombre de neurones DRG récoltées à partir de différents animaux. Pour cette raison, les résultats peuvent être parfois difficile de COMPARe et une attention particulière devrait être accordée au cours de la procédure d'ensemencement afin de toujours obtenir une densité cellulaire comparable dans chaque expérience. Le protocole a été optimisée afin de réduire au minimum le nombre de cellules satellites restants de la dissociation des neurones DRG en utilisant le gradient de BSA (étape 3.11). En outre, la cytosine-arabinose (ARA-C) supplément peut être ajouté au milieu de BS afin de réduire davantage la population cellulaire par satellite, tel que décrit par Kingham et al. 11. Cependant, le choix de la durée du traitement doit être soigneusement équilibrée avec le DRG et SC-ASC comme vitalité, également affectée par la présence d'ARA-C supplément dans le milieu de culture. Par conséquent, il est très difficile de réaliser un système exempt de cellules par satellite. La figure 2 montre l'importance de l'ASC comme SC-DRG neurite pour la germination dans un modèle de co-culture en utilisant des poly non traité et modifié chimiquement – caprolactone (PCL) films comme substrats. Neurones DRG étaient maintained en culture pendant 3 jours en présence ou en l'absence de SC-like ASC, en utilisant une solution mélangée contenant 50% de milieu BS et 50% de milieu de différenciation de cellules souches, de la manière décrite dans l'étape 4.5. Après cette période, les cellules ont été fixées dans 4% de paraformaldehyde et colorées avec β-tubuline III (neurones DRG) et S100 (SC-like ASC) d'enquêter sur la morphologie des cellules et d'étudier la capacité des neurones DRG pour dépasser neurites. Aucun des neurites ont été observés sur des surfaces non traitées en l'absence de SC-like ASC (figure 2A), tandis que la formation des neurites a été nettement améliorée dans le système de co-culture (figure 2C). En moyenne, le nombre de neurites par corps cellulaire significativement accrue de 0 à 3 en présence de cellules souches. La confirmation de ces résultats a également été donnée par microscopie électronique à balayage (MEB) d'analyse, représenté sur la figure 3. En particulier, les images au MEB montrent que la capacité des neurones de DRG à germer neurites se produit de préférence en conjonctionavec comme SC-ASC, comme indiqué par les flèches sur la figure 3C jaunes. Il convient de souligner que l'utilisation de substrats de laminine modifié (y compris les peptides tirés de la laminine) dans les systèmes de culture contenant les neurones de DRG a souvent été définie comme un état ​​convenable pour la culture de cellules neuronales, ayant des effets remarquables sur la formation des neurites et l'extension de 30 à 32 . Cependant, les résultats présentés à la figure 2D et la figure 3D montre que la combinaison de signaux chimiques et biologiques peut en outre améliorer la réponse des neurones de DRG. Figure 1. Préparation du système ASC co-culture DRG-SC-like directe. Neurones DRG et l'ASC sont dérivées respectivement de la colonne vertébrale et la graisse viscérale et inguinale du mal adultee rats Sprague-Dawley. Après la digestion du tissu adipeux par une cascade de réactions enzymatiques, ASC sont différenciées en cellules SC-like et maintenu dans des conditions sub-confluentes jusqu'à utilisation. SC-like ASC sont pré-ensemencés sur chaque substrat 24 heures avant la récolte de DRG. Le jour, les neurones de DRG dissociés sont extraits et une série d'actions enzymatiques et mécaniques. Les neurones sont ensuite ensemencées sur le haut de l'ASC de SC comme précédemment ensemencée et maintenues en culture jusqu'à l'essai (milieu mixte: contenant 50% de la tige milieu de différenciation cellulaire et 50% de milieu de BS modifié). Se il vous plaît, cliquez ici pour afficher une plus grande version de ce chiffre. Figure 2. fluorescence images de neurones DRG dans des conditions de culture différentes.(A) des films PCL non traités; (B) des films PCL RGD modifiés; (C) co-cultivées avec des SC comme ASC sur les films PCL non traités; (D) co-cultivées avec des SC comme ASC sur les films PCL RGD modifiés. Les cellules ont été maintenues en culture pendant 3 jours en utilisant une solution mélangée contenant 50% de milieu de BS modifié et 50% de milieu de différenciation de cellules souches. Après ce temps, les cellules ont été fixées dans 4% de paraformaldehyde, perméabilisées dans une solution de Triton-X, et les sites de liaison non spécifiques ont été bloqués avec 1% de BSA. Cellules neuronales ont ensuite été colorées contre la β-tubuline III (FITC; vert) et SC-like ASC contre S-100 (AlexaFluor568; rouges) anticorps. Enfin noyaux ont été colorés avec du DAPI (bleu). Les images ont été acquises en utilisant un microscope à fluorescence (Olympus BX60, Japon). (Re-print avec la permission de de Luca et al. 30. Se il vous plaît cliquer ici pour voir un plus grand version de ce chiffre. Figure 3. images SEM de neurones DRG dans des conditions de culture différentes (A) des films PCL non traitées (B) des films PCL RGD modifiés;. (C) co-cultivées avec des ASC SC-comme sur films PCL non traités; (D) co-cultivées avec SC-ASC comme le PCL films de RGD modifié. Les flèches jaunes indiquent les points de contact entre SC comme ASC et DRG, confirmant leur interaction directe dans le système de co-culture. Les cellules ont été maintenues en culture pendant 3 jours et fixées dans 2,5% de glutaraldéhyde. À la suite de la déshydratation en série graduée d'éthanol (50%, 70%, 90%, 100%), les cellules sont finalement rincées à l'hexaméthyldisilazane et on les sèche avant de monter sur les moignons et de l'or de pulvérisation pour l'analyse SEM. Les images ont été acquises à l'aide d'une SEM (Zeiss EVO60, Royaume-Uni) avec un vol accélérationtage de 10kV. (Re-print avec la permission de de Luca et al. 30. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Neurones DRG sont fréquemment utilisés chez les cellules neuronales pour la culture primaire pour étudier la régénération des neurones après axotomie in vivo. Voici un protocole précis pour la récolte de DRG de rats adultes est présentée, visant à réduire la population de cellules satellites dans l'environnement sans compromettre la survie neuronale. Comme ASC différenciées en un phénotype SC-like sont une alternative valable à SC pour les thérapies cellulaires, un système de co-culture ASC / DRG SC-like est également décrite en détail.

Il est largement connu que la laminine (ou séquences peptidiques laminine dérivés) ont un effet bénéfique sur la survie des neurones et la formation de neurites ^31-33. Lors de la réalisation des cultures de neurones de DRG il est donc conseillé de chaque couche précédemment substrat de laminine, afin d'éviter toute perte de fonctionnalité des cellules neuronales. Le concept de revêtements de laminine se applique également à des substrats de biomatériau pour la conception deconstructions d'ingénierie de tissus, tels que le poly – caprolactone (PCL) fréquemment utilisés pour la fabrication de conduits ³⁰ nerveuses. En outre, des travaux antérieurs ont démontré que des matrices de fibrine sont des matériaux appropriés pour des cultures de neurones en trois dimensions ^11.

En plus de revêtement de protéines, les modèles de co-culture offrent des conditions intéressantes pour la survie des neurones DRG et un environnement approprié pour étudier les interactions qui se produisent entre les neurones et SC dans le système nerveux périphérique après une lésion. Les cellules peuvent également être transplantées in vivo en utilisant des dispositifs de neurones afin de raccourcir le temps de recrutement de cellules autologues au site de la lésion. Ceci est particulièrement important dans des blessures graves, qui peuvent conduire à la sénescence cellulaire / mort et l'atrophie musculaire. Bien que SC sont les cellules gliales les plus importants impliqués dans le processus de régénération du nerf périphérique et la myélinisation, leur disponibilité limitée et leur taux de prolifération lente les rend improprespour les applications d'ingénierie tissulaire ^34. ASC sont une alternative valable en raison de leur abondance et leur capacité à se différencier dans le phénotype de SC, exprimant des marqueurs spécifiques gliales et montrant des similitudes fonctionnelles native SC ^19. ASC sont également capables de produire des protéines et facteurs de croissance ⁵ qui peuvent être bénéfiques à la formation et l'extension des neurites par les neurones DRG dans un système de co-culture. Cependant, deux systèmes de co-culture différente peuvent être mis en place en fonction des besoins expérimentaux. La méthode proposée dans le présent document est une version révisée d'un protocole bien établi dans notre laboratoire ¹¹ et il se agit d'un contact direct entre les deux types de cellules (co-culture directe), dans lequel le second type de cellules (neurones DRG) sont ensemencées sur le dessus des autres (SC-like ASC). Cette approche est basée sur les conclusions précédentes qui ont démontré l'importance de la présence d'une couche de cellules gliales sur le substrat lorsque l'ensemencement des cultures de neurones ³⁵ <sup> – ^37. Cet effet est probablement dû à des interactions cellule-cellule par l'intermédiaire des intégrines et des DRG molécules de la MEC déposées à partir ASC et d'autres indices sur la surface de cellules souches. On a également constaté qu'une réduction de sérum de protéine dans le milieu a réduit la prolifération de cellules satellites contaminantes qui peuvent découler de la dissociation des neurones DRG, sans affecter les fonctions de l'ASC. Cependant, les cellules satellites, y compris une petite population de SC, sont difficiles à éliminer complètement à partir de cultures de neurones de DRG et quelques cellules restantes seront également présents dans le système de co-culture. Il est donc important de noter que ces petites sous-populations peuvent également participer aux processus de myélinisation lors d'études in vitro, rappelant les cellules autologues qui sont présents in vivo après une blessure. La deuxième approche (non présentée ici) implique l'utilisation d'inserts de culture cellulaire, en évitant un contact direct entre les deux types cellulaires différents (co-culture indirecte). Howeveuh, ce ne est pas représentatif des conditions in vivo au cours de la régénération nerveuse (réduction de la capacité des cellules neuronales de développer longs neurites), mais il est utilisé pour étudier l'effet de facteurs diffusibles libérés dans le milieu par une certaine population de cellules sur la ³⁸ autres .

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
100 µm cell strainer	BD Biosciences	352360	70 μm strainers (ref. 352350) can be used as alternative
15 mL plastic tubes	Sarstedt	62.554.002
50 mL plastic tubes	Sarstedt	62.547.004
75 cm2 flasks	Corning	BC301
Retinoic Acid >98% HPLC	Sigma	R2625
ARA-C supplement	Sigma	C6645
Recombinant Human FGF-basic (154 aa)	Peprotech	100-18B
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9205
Collagenase type I	Gibco	17100-017	Note: this collagenase is only used for fat tissue digestion
Collagenase type IV	Worthington Biochemical	LS004188	Note: this collagenase is only used to dissociate DRG explants
Foetal Bovine Serum (FBS)	Biosera	FB-1001
Forskolin	Sigma	F3917
Glass pipettes	Fisher Scientific	FB50253	Sharp material to be disposed accordingly
Glial Growth Factor-2 (GGF-2)	Acorda Therapeutics		GGF-2 was kindly donated by Acorda Therapeutics. For a commercially available alternative, we recommend NRG1-β1 (R & D Systems, Abingdon) for stem cell differentiation to be used at the final concentration of 200ng/ml
Nutrient Mix F12 HAM	Sigma	N6658	Warm at 37 °C in a water bath unless specified
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma	H9394	Warm at 37 °C in a water bath unless specified
N-2 supplement (100x)	Invitrogen	17502
Nerve Growth Factor 2.5s Protein, Mouse Submaxillary Glands  (NGF)	Millipore	NC011
Penicillin-Streptomycin (PS)	Sigma	P0781
Petri dishes	Corning	430165
Recombinant Human PDGF-AA	Peprotech	100-13A
Trypsin	Invitrogen	25200-056	Warm at 37 °C in a water bath. This is used for cell detachment from tissue culture flasks
Trypsin (2x bovine pancreatic)	Worthington Biochemical	LS003703	This is used for DRG dissociation
Minimum Essential Medium Eagle (MEM)	Sigma	M8042	Warm at 37 °C in a water bath unless specified
2-mercaptoethanol	Sigma	M3148	Prepare the solution in the biological cabinet