Direct Eiwit Levering aan zoogdiercellen behulp van Cell-permeabel Cys<sub> 2</sub> -Zijn<sub> 2</sub> Zinkvinger Domeinen
Summary
Zinkvinger domeinen zijn intrinsiek cel permeabel en geschikt mediëren eiwit plaatsing in een breed scala aan zoogdier celtypen. Hier wordt een uitvoerige stap-voor-stap-protocol voor de uitvoering van zink-vinger-technologie voor intracellulaire eiwit levering gepresenteerd.
Abstract
Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.
Introduction
Zeer efficiënte en veelzijdige eiwit levering strategieën zijn van cruciaal belang voor veel fundamenteel onderzoek en therapeutische toepassingen. De directe afgifte van gezuiverde eiwitten in cellen vormt een van de veiligste en eenvoudigste methoden om dit. 1,2 Unlike strategieën afhankelijk genexpressie van nucleïnezuren, eiwitten 5/3 levering geen gevaar dat mutagenese, onafhankelijk van de cellulaire transcriptie / translatie machines en zorgt voor een onmiddellijk effect. Echter, het ontbreken van eenvoudige en generaliseerbaar methoden voor begiftigt celpenetrerende activiteit op eiwitten routinematig verwart hun directe binnenkomst in cellen. Huidige werkwijzen voor intracellulair eiwit levering faciliteren zijn gebaseerd op het gebruik van natuurlijk voorkomende 6-8 of gemaakt cel penetrerende peptiden 9-12 supercharged transductie domeinen 13,14 nanodeeltjes 15 en liposomen, 16 virusachtige partikels 17,18 </sup> en polymere microsfeer materialen. 19 Helaas zijn veel van deze benaderingen worden gehinderd door lage cellulaire opname prijzen, 20,21 slechte stabiliteit, 22 onbedoelde celtype specificiteit, 23 lage endosomale ontsnapping eigenschappen 24 en toxiciteit. 25 Bovendien zijn veel eiwitten transductie technologieën verminderen de biologische activiteit van de geleverde eiwitten. 14
Ons laboratorium eerder aangetoond dat zink-vinger nuclease (ZFN) eiwitten – chimeer beperking endonucleases bestaande uit een programmeerbare Cys 2 -Zijn 2 zinkvinger DNA-bindende eiwitten en de splitsing domein van de FokI restrictie endonuclease 26-28 – zijn inherent cel- doorlaatbaar. 29 Dit verrassende celpenetrerende activiteit werd aangetoond dat het een intrinsieke eigenschap van de op maat ontworpen zink-vinger domein van een DNA-bindende platform dat heeft ontpopt als een krachtig hulpmiddel voor gerichte genoom en zijngineering, 30-32 en als het resultaat van de constellatie van zes positief geladen resten op het eiwit oppervlak. Inderdaad hebben verscheidene DNA-bindende eiwitten, waaronder c-Jun en de N-DEK blijkt een aangeboren vermogen om celmembranen bezitten. 33 Recentelijk ons laboratorium breidde deze resultaten en toonde dat de cel penetrerende werking van zink vinger (ZIF) domeinen kunnen worden ingezet voor intracellulaire eiwit levering. Genetische fusie van enkelzijdige of vingers ZIF domeinen specifiek eiwit lading tot efficiëntie dat veel conventionele celpenetrerende peptide afgiftesystemen overschreden opname. 34 Met name Zif-gemedieerde aflevering niet de activiteit van gesmolten enzymatische lading beschadigen en vergemakkelijkt hoge cytosolische levering. Tezamen zijn deze bevindingen tonen het potentieel van de Zif domein die een efficiënte en gemakkelijke afgifte van eiwitten en mogelijk diverse soorten macromoleculen in cellen.
Hier wordt een uitvoerige stap-voor-stap-protocol over het implementeren van ZIF technologie voor proteïne levering in zoogdiercellen gepresenteerd. We hebben eerder geconstrueerd een reeks een-, twee-, drie-, vier-, vijf- en zes vingers ZIF domeinen die het vermogen om DNA te binden, door substitutie van elk van de α-helix DNA-bindende residuen missen, maar kunnen leveren eiwitten in cellen 34 (figuur 1). De productie en overdracht van Emerald GFP (EmGFP) in HeLa-cellen met behulp van een twee-vinger ZIF domein wordt beschreven. Dit protocol is uitbreidbaar tot bijna elk eiwit dat oplosbaar expressie in Escherichia coli en bijna elk zoogdier celtype. Verwachte resultaten worden verstrekt en strategieën voor het maximaliseren van de prestaties van dit systeem worden ook besproken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier is een stap-voor-stap protocol voor eiwit aflevering met behulp van cel-permeabele zinkvinger (ZIF) domeinen gepresenteerd. De ZIF domein niet de activiteit van gesmolten enzymatische lading 34 te verminderen; maakt de productie en zuivering van eiwitten in opbrengsten nagenoeg identiek aan die waargenomen met ongemodificeerde eiwit; en kunnen eiwitten en enzymen in diverse celtypen te transporteren met rendementen traditionele celpenetrerende peptide of eiwit transductie domein te boven gaat. Samen vorm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (DP1CA174426 naar Carlos F. Barbas) en ShanghaiTech University, Shanghai, China (naar JL). Moleculaire graphics werden gegenereerd met behulp van PyMol.
Materials
| XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
| SacI | New England Biolabs | R0156L | |
| Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
| 4-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
| T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
| IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
| DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| 24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
| Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
| Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
| Hela cells | ATCC | CCL-2 | |
| Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Berg, A., Dowdy, S. F. Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).
- Lindsay, M. A. Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation. Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).
- Luo, D., Saltzman, W. M. Synthetic DNA delivery systems. Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).
- Guo, X., Huang, L. Recent advances in nonviral vectors for gene delivery. Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
- Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55, 1189-1193 (1988).
- Elliott, G., O’Hare, P. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell. 88, 223-233 (1997).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).
- Smith, B. A., et al. Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display. J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).
- Daniels, D. S., Schepartz, A. Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif. J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).
- Karagiannis, E. D., et al. Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library. ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).
- Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r, S., Banta, An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform. ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).
- Fuchs, S. M., Raines, R. T. Arginine grafting to endow cell permeability. ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).
- Cronican, J. J., et al. Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein. ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).
- Panyam, J., Labhasetwar, V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).
- Zelphati, O., et al. Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system. J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).
- Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).
- Voelkel, C., et al. Protein transduction from retroviral Gag precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).
- Sinha, V. R., Trehan, A. Biodegradable microspheres for protein delivery. J. Control Release. 90, 261-280 (2003).
- Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering. PLoS One. 9, e85755 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).
- Fuchs, S. M., Raines, R. T. Polyarginine as a multifunctional fusion tag. Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).
- Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate. J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).
- Al-Taei, S., et al. Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors. Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).
- Jones, S. W., et al. Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery. Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. 遗传学. 188, 773-782 (2011).
- Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F., 3rd, Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
- Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).
- Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F., 3rd, Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies. Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
- Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. Advances in targeted genome editing. Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).
- Cronican, J. J., et al. A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo. Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).
- Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains. ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).
- Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. Basics of flow cytometry. Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).
- Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors. ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).
- Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F., Horton, N. C. Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA. J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).
