本研究介绍了一种新颖的实验模型，该模型将三维神经元培养物与平面微电极阵列（MEAs）相结合。三维神经网络通过在由玻璃微珠构成的支架上接种神经元而构建，神经元在支架上生长并形成相互连接的三维结构。
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摘要
摘要
目前，大规模网络由解离的神经元在生长和发育过程中形成 体外 细胞外微传感器装置是研究神经元细胞群形成与维持过程中所涉基本神经生理学机制的金标准实验模型。然而 体外 以往的研究局限于记录由二维（2D）神经网络产生的电生理活动。然而，鉴于结构与动力学之间复杂的相互关系，有必要进行显著改进，以深入研究三维（3D）神经网络的形成过程及其动态发展。本文介绍了一种新颖的实验平台，该平台将3D海马体或皮层神经网络与平面微电极阵列（MEAs）相耦合。3D神经网络通过在由玻璃微珠（直径30-40 µm）构成的支架上接种神经元而构建，神经元可在其上生长并形成复杂的相互连接的3D结构。通过该方法，可构建由5-8层组成的工程化3D神经网络，并达到预期的最终细胞密度。3D结构在形态组织上的复杂性增加，导致此类网络所呈现的电生理活动模式显著增强。与标准2D神经网络中出现的高度刻板化的簇状放电活动相比，3D结构在放电活动的持续时间与频率方面均发生改变，同时还能观察到更为随机的单个动作电位活动。因此，所构建的3D模型在功能特性上更接近于 体内 神经网络
引言
体外二维（2D）神经网络与微电极阵列（MEAs）耦合，是研究神经元动力学与底层连接性之间相互作用的标准实验模型。1,2（即，簇发放电、网络簇发放电、随机放电活动）。MEAs 可从多个位点（从数十到数千个微电极）记录电生理活动，从而在网络水平上对所表现出的动力学进行详细研究。此外，使用离体培养的细胞可实现工程化网络的设计。通过这种方式，更容易理解所记录的电生理活动与网络结构参数（如细胞密度3、模块化程度4,5、异质性神经元群体的存在6等）之间的功能关系。然而，所有关于离体培养细胞的体外研究均基于二维神经网络。该方法相对于体内（本质上为三维，3D）系统存在过度简化的问题：（i）在二维模型中，胞体和生长锥被压平，轴突和树突的生长无法在所有方向上自由延伸7；（ii）二维体外网络表现出以簇发放电为主导的刻板电生理动力学特征，涉及网络中大多数神经元8。
最近，已开发出不同的解决方案，以实现构建 体外 三维解离神经网络。其基本思路是构建一种支架，使神经元能够在三维环境中生长。这种支架可通过聚合物凝胶和固体多孔基质来实现。9-13利用聚合物的机械特性，可通过定义神经球的三维培养均匀块状结构，将细胞包埋于这些结构内部。11
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方案
本实验方案已获欧洲动物护理立法（2010/63/EU）、意大利卫生部依据 D.L. 116/1992 法令以及热那亚大学指南（编号 13130，2011 年 5 月）的批准。本项目已尽一切努力减少动物使用数量，并最大限度减轻其痛苦。
1. 材料与载体的准备
- 使用数控（CNC）铣床构建用于制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）约束结构的模具。该模具由聚碳酸酯制成，中心圆柱部分采用聚四氟乙烯（PTFE）。该材料有助于在PDMS固化后更轻松地取出掩模。
注意：模具的设计通过计算机辅助设计（CAD）完成，随后导入数控铣床进行加工。 - 配制PDMS弹性体。PDMS是一种有机聚合物，由两种组分构成：固化剂和聚合物。按1:10的体积比混合，即1份固化剂与9份聚合物。将两种组分放入培养皿中，振荡混匀后置于真空腔中抽气10分钟 以去除气泡。每制作一个约束结构需使用3 g PDMS即可。
- 制备PDMS约束结构。将PDMS材料注入模具中，放入烘箱于120 °C加热30分钟 。所得PDMS约束结构呈理想圆柱形，外径为22.0 mm，内径为3.0 mm，高度为650 µm。
- 在细胞接种前一天，在体视显微镜下使用镊子将掩模精确对准微电极阵列（MEAs）的活性区域，并将PDMS掩模置于120 °C烘箱中灭菌。
- 将玻璃微珠（标称直径为40±2 µm；认证平均直径为42.3....
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结果
在此实验过程中，微珠在构建三维神经元网络的机械支架中起着关键作用。图1A和B展示了微珠在平面上的排列情况（标称直径为40±2 µm；认证平均直径为42.3±1.1 µm）。这类结构的特点是微珠能够自发地自组装成致密的六边形几何构型（图1B和C）。由此形成的支架为神经突提供了稳定的生长表面，同时为细胞体的代谢交换保留了足够大的间隙空间。该微珠尺寸在间隙大小与最终神经元密度之间实现了合理折衷。考虑到PDMS结构模拟了一个“理想”圆柱体，且致密六边形结构的填充因子（HPF）为0.74，因此在PDMS限定空间内最多可容纳约100,000个微珠（直径40 µm），相当于每层约含6,000个微珠。如方案部分所述，这些微珠预先用黏附因子（即层粘连蛋白和多聚-D-赖氨酸）进行预处理，以确保神经元能够附着于微珠表面。图1D展示了一个示例，其中三个神经元连接在一个直径为40 µm的微珠上。
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讨论
在此研究中，一种新颖的实验方法 体外 由3D工程化神经元培养物与微电极阵列（MEA）耦合构成的用于神经网络电生理学研究的平台已被提出。利用微珠作为支架，可促进神经突沿其结构生长 z-轴已针对平面MEA进行了定制化设计，从而使得所获得的微系统具有良好的有效性和可靠性 体外 用于研究涌现性电生理动力学的三维模型16.
MEA 记录装置
MEA 器件由一个培养室组成，其内集成了嵌入基底的微电极阵列，能够记录来自电活性组织的细胞外信号。典型的记录信号包括峰电位（spikes）即， 单个超阈值电压变化，代表一个或多个神经元的电活动）和簇发（burst）即， 高度密集的尖峰序列，常在多个通道上同时出现）。基于MEA系统的神经元网络活动记录会产生海量数据（例如， 4 小时的实验使用 60 通道的 MEA 会产生约 15 GB 的记录数据。这意味着需要高效的工具来处理和分析数据，尤其是在需要长时间记录的研.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
作者感谢 Giorgio Carlini 在构建限位结构过程中提供的技术支持，感谢 dott. Ornella LoBrutto 对稿件的仔细审阅。本研究工作获得了欧洲联盟第七个th 欧盟第七框架计划（信息与通信技术—未来新兴技术，2007–2013年），FET青年探索者计划，资助协议号284772 BRAIN BOW（www.brainbowproject.eu）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 层粘连蛋白 | Sigma-Aldrich | L2020 | 0.05 µg/ml |
| 多聚-D-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P6407 | 0.05 µg/ml |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 25050-014 | 0.125%，用不含 Ca++ 和 Mg++ 的 HBSS 按 1:2 稀释 |
| 脱氧核糖核酸酶 | Sigma-Aldrich | D5025 | 0.05%，用汉克斯溶液稀释 |
| Neurobasal | Gibco Invitrogen | 21103049 | 培养基 |
| B27 | Gibco Invitrogen | 17504044 | 2% 培养基添加剂 |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma-Aldrich | F-2442 | 10% |
| Glutamax-I | Gibco | 35050038 | 0.5 mM |
| 庆大霉素 | Sigma-Aldrich | G.1272 | 5 mg/L |
| 聚二甲基硅氧烷（PDMS） | Corning Sigma | 481939 | 固化剂和聚合物 |
| 微电极阵列 | Multi Channel Systems (MCS) | 60MEA200/30-Ti-pr | MEA 参数：电极网格 8×8；电极间距和直径分别为 200 和 30 µm；无螺纹塑料环 |
| 微珠 | Distrilab-Duke Scientific | 9040 | 1 克 玻璃微粒标准品，粒径 40 µm |
| Transwell | Costar Sigma | CLS 3413 | 带膜插件的多孔板（孔径 6.5 mm，孔隙 0.4 µm） |
| 不含 Ca++ 和 Mg++ 的 HBSS | Gibco Invitrogen | 14175-052 | |
| 汉克斯缓冲液 | Sigma | H8264 | |
| 特氟龙 | Sigma | 430935-5G | 聚四氟乙烯 |
| 大鼠 | Sprague Dawley | Wistar 大鼠 | |
| 直立式共聚焦显微镜 | Leica | TCS SP5 AOBS | |
| 20.0×0.50 WATER 物镜 | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 40.0×0.80 WATER 物镜 | Leica | Leica HCX APO L U-V-I | |
| 25.0×0.95 WATER 物镜 | Leica | HCX IRAPO L |
参考文献
- Van Pelt, J., Corner, M. A., Wolters, P. S., Rutten, W. L. C., Ramakers, G. J. A. Long-term stability and developmental changes in spontaneous network burst firing patterns in dissociated rat cerebral cortex cell cultures on multi-electrode arrays. Neurosci. Lett. 361, 86-89 (2004).
- Rolston, J. D., Wagenaar, D. A., Potter, S. M.
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重印与许可
