兔心Langendorff灌注模型中肌浆网内Ca2+及跨膜电位的光学标测

摘要

本文介绍了在经Langendorff灌注的兔心脏中进行跨膜电位（V_m）和肌浆网内游离钙离子（SR Ca²⁺）双光学标测所需的详细方案及设备。该方法可实现对完整心脏中V_m和SR Ca²⁺动态变化的直接观察与定量分析。

摘要

肌浆网（SR）Ca²⁺调控在正常的兴奋-收缩耦联中起关键作用，而异常的肌浆网Ca²⁺调控已被证实参与某些类型心律失常的发生。由于心律失常是具有空间特异性的涌现现象，因此必须在组织水平上进行研究。然而，目前仍缺乏在完整心脏中直接探测肌浆网Ca²⁺的方法。本文介绍了在Langendorff灌注兔心脏中对跨膜电位（V_m）和肌浆网内游离[Ca²⁺]（[Ca²⁺]_SR）进行双光学标测的技术方案。该方法利用低亲和力Ca²⁺荧光探针Fluo-5N，该探针在细胞质中荧光信号微弱，因为细胞内[Ca²⁺]（[Ca²⁺]_i）相对较低；但在[Ca²⁺]_SR处于毫摩尔浓度范围的肌浆网腔内则表现出显著荧光。除了能够空间性地揭示心脏心外膜表面的肌浆网Ca²⁺特征外，该方法还具有同时监测V_m的独特优势，从而可研究V_m与肌浆网Ca²⁺之间的双向关系，以及肌浆网Ca²⁺在致心律失常现象中的作用。

引言

在完整的小鼠离体Langendorff灌注心脏中，同时进行细胞内Ca²⁺和跨膜电位（V_m）的双光学标测，已成为心脏电生理学研究中的核心技术手段，广泛应用于心律失常机制及兴奋-收缩耦联的研究^1-4。该方法极大地推动了对正常与异常电生理活动的认识，尤其深化了对V_m与细胞内Ca²⁺之间双向关系的理解。然而，使用高亲和力荧光探针（如Rhod-2和Fluo-4）进行细胞内Ca²⁺的光学标测仅能反映细胞内Ca²⁺的整体变化，无法区分这些变化是源于跨膜Ca²⁺流动、细胞内储存池的释放与再摄取，还是多数情况下两者的共同作用。此外，高亲和力Ca²⁺探针具有较慢的结合与解离动力学特性，可能无法准确反映Ca²⁺浓度的快速变化⁵。

每个动作电位都会引发细胞内 Ca²⁺ 浓度的升高，称为细胞内 Ca²⁺ 瞬变（CaT）。在哺乳动物心脏中，总 CaT 的约 70–90% 是由于肌浆网（SR）中的兰诺定受体（RyRs）开放，导致 Ca²⁺ 从肌浆网释放所致⁶。在肌浆网内，大约一半的总 Ca²⁺ 与钙结合蛋白（calsequestrin, CSQ）及其他肌浆网内....

方案

所有涉及动物的实验程序均经加州大学戴维斯分校动物护理与使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理与使用指南》。

1. 准备

1. 提前配制两种浓缩（25倍）改良Tyrode’s溶液，并于4 °C保存：（1）储备液I（单位为mM：NaCl 3,205，CaCl₂ 32.5，KCl 117.5，NaH₂PO₄ 29.75，MgCl₂ 26.25）；（2）储备液II（单位为mM：NaHCO₃ 500）。
   1. 新鲜配制2 L以下成分的Tyrode’s溶液（单位为mM：NaCl 128.2，CaCl₂ 1.3，KCl 4.7，MgCl₂ 1.05，NaH₂PO₄ 1.19，NaHCO₃ 20，葡萄糖11.1），方法为将1840 ml 去离子水（DI）、80 ml 储备液I、80 ml 储备液II以及4 g葡萄糖混合。切勿直接混合储备液I与储备液II；应分别加入1840 ml 去离子水中，以避免沉淀产生。
2. 提前用无水二甲基亚砜（DMSO）配制浓度为10 mg/ml的兴奋-收缩解偶联剂blebbistatin储备液，并将该储备液置于....

结果

图1A 展示了双V光学构型的示意图_m 和肌浆网钙²⁺ 成像。在此设置下，V 的光谱完全分离_m 和SR钙²⁺ 信号（图1B用于Fluo-5N染料负载的双循环灌流系统的示意图如图所示 图1C. 图1D 显示心脏在灌注皿中的水平方向。代表性 V_m 和SR钙²⁺ 心脏心外膜表面不同位置连续起搏期间的光学信号轨迹如图所示 图2A该装置的光学视场为31 mm × 31 mm，心脏在视场中的方位如图所示。 图2B激活图谱也显示在 图2B 并通过对每个像素的激活时间进行选择，将该值绘制在等时图上（注意V之间典型的延迟约为8-10毫秒）_m 和肌浆网钙²⁺ 激活图）。重要的是，关键的动作电位（AP）特性，如动作电位上升时间（从幅度的10%到90% [.......

讨论

成功加载Fluo-5N染料的关键在于使用小体积循环灌流装置，该装置可在无需大量染料的情况下实现高浓度Fluo-5N的加载、加载时间（1小时）以及在室温（RT）下进行加载。若在生理温度下进行加载，当染料穿过细胞膜时，细胞内的酶活性会迅速切割–AM基团，导致染料分子被困在细胞质中，无法穿过肌浆网（SR）膜。然而，在室温下，酶活性减缓，足够量的染料可在–AM基团被切割前同时穿过细胞膜和肌浆网膜，从而使染料被 trapping 在肌浆网内。

然而，即使在最佳加载条件下，采用这种方法获得的信号幅度以及荧光变化比率（ΔF/F）仍低于使用高亲和力染料进行传统光学映射膜电位（V_m）和细胞内 Ca²⁺ 所达到的水平。例如，在本实验所使用的光学系统中，激发光源为LED，配备大视野物镜、大型滤光片和二向色镜（5 cm × 5 cm）以及CMOS相机，Fluo-5N信号的荧光变化比率（ΔF/F）约为1–2%，RH237信号则约为2–3%¹⁵。当然，荧光变化比率取决于特定的光学配置、光源和相机系统，但即使在最优条件下，Fluo-5N信号仍显著.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaCl	Fisher Scientific	S271-1	台氏液组分
CaCl2 (2H2O)	Fisher Scientific	C79-500	台氏液组分
KCl	Fisher Scientific	S217-500	台氏液组分
MgCl2 (6H2O)	Fisher Scientific	M33-500	台氏液组分
NaH2PO4 (H2O)	Fisher Scientific	S369-500	台氏液组分
NaHCO3	Fisher Scientific	S233-3	台氏液组分
D-葡萄糖	Fisher Scientific	D16-1	台氏液组分
95% O2 5% CO2	AirGas	carbogen	用于台氏液的氧合与pH调节
布雷比汀（Blebbistatin）	Tocris Bioscience	1760	兴奋-收缩解偶联剂
RH237	Biotium	61018	电压敏感性染料
Fluo-5N AM	Invitrogen	F-26915	低亲和力Ca2+指示剂；替代品：Invitrogen F-14204；必须在室温下进行负载
Pluronic F127	Biotium	59004	用于Ca2+指示剂负载；使用前加热至溶液澄清
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D2650	用于溶解布雷比汀和染料
滤器	EMD Millipore	NY1104700	11 μm在线滤器
压力传感器	WPI	BLPR2	用于测量灌注压力
Transbridge信号放大器	WPI	SYS-TBM4M	用于压力信号的转换与放大；也可使用配备适当BioAmp的PowerLab系统
PowerLab 26T	ADInstruments		用于连续记录压力和心电图信号
THT宏观成像系统	SciMedia		宏观光学装置。详细参数：0.63倍物镜（NA = 0.31），2倍聚光物镜，最终视场为3.1 cm × 3.1 cm，焦深约1.5 mm
MiCam Ultima-L CMOS	SciMedia		光学标测相机
精密LED点光源	Mightex	PLS-0470-030-15-S	LED光源