通过16S rRNA基因测序与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定罕见细菌病原体

摘要

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）与分子技术（16S rRNA 基因测序）可实现对常规诊断中罕见细菌病原体的鉴定。本方案的目标在于结合这两种技术，从而获得更准确、更可靠的数据。

摘要

存在多种罕见且因此描述尚不充分的细菌病原体，据报道可导致免疫功能低下患者发生严重感染。大多数情况下，仅有一些少量数据（多以病例报告形式发表）用于研究这些病原体作为感染因子的作用。因此，为了明确此类微生物的致病特性，有必要开展包含大量此类细菌的流行病学研究。此类监测研究中所采用的方法必须满足以下标准：菌株鉴定需符合现行命名法规且准确可靠，操作简便（具有稳健性），适用于常规诊断并具有经济性，且能够在不同实验室之间产生可比结果。通常，在常规检测中鉴定细菌菌株有三种策略：1）表型鉴定，通过表征细菌的生化与代谢特性进行鉴定；2）分子技术，如16S rRNA基因测序；3）基于蛋白质组学的新型方法——质谱分析。由于质谱分析和分子技术是鉴定多种细菌物种最具前景的工具，本文将重点描述这两种方法，并讨论其应用中的进展、局限性及潜在问题。

引言

在常规诊断中，罕见病原体的准确鉴定受到限制，原因是传统的培养和生化方法操作繁琐且有时结果不可靠。此外，临床微生物学实验室每天需要处理大量病原体，数量从数百到数千不等，因此必须依赖自动化系统。除了实现高通量日常检测外，还需精确鉴定细菌种类，因为不同菌种的抗菌药物敏感性模式存在差异，准确鉴定可为临床医生选择合适的抗生素提供关键信息（例如，Enterococcus spp.、Acinetobacter spp.）^12,43。

自动化微生物鉴定系统（aMIS）采用标准化的酶促反应组来表征细菌分离株的代谢特性 ^{13,15,16,26,27}尽管这些系统中使用的试剂盒采用了大量不同的生化反应， 例如， 本研究中所用aMIS的GN卡中的47 ⁵²，该策略仅能对有限种类的细菌实现可靠鉴定。此外，该数据库作为一个高级专家系统，明显侧重于检测具有医学重要性的相关及高度相关细菌 ^13,15,16,36另外两种在实验室中广泛使用的系统也采用这种生化方法进行细菌鉴定。近期研究表明，本研究中使用的aMIS与其中一种竞争系统在鉴定准确性方面相当（分别为93.7%和93.0%），而3^rd aMIS在物种水平上的鉴定准确率仅为82.4% ³⁵这些差异可能源于基础鉴定数据参考的质量、试剂盒和软件的版本、代谢差异以及技术人员的操作熟....

方案

1. 细菌DNA的提取

1. 磷酸盐缓冲液（PBS）溶液的配制
   1. 称取1.65 g Na₂HPO₄ x 2H₂O、0.22 g NaH₂PO₄ x 2H₂O 和 8.80 g NaCl 置于烧瓶中，加入蒸馏水定容至 1,000 ml，调节 pH 至 7.4。使用细菌过滤器（0.22 µm）过滤溶液，以供最终使用。
2. 革兰氏阴性菌的DNA提取
   1. 将患者样本划线接种于合适的培养基（例如，哥伦比亚血琼脂），鉴定并分离潜在病原体。
   2. 制备纯培养物，并进行革兰氏染色，以确定菌体形态并确认培养物的纯度⁴⁹。
   3. 用1 µl一次性接种环挑取单个细菌菌落，转移至含有1 ml PBS溶液的无菌2.0 ml离心管中。
   4. 将该悬浮液在恒温混匀仪中95 °C孵育10分钟。孵育后，使细菌裂解液（含溶解的DNA）冷却至室温，可直接用于扩增，或于-20 °C保存以备后续使用（图1a）。
3. 革兰氏阳性菌的DNA提取
   1. 将患者样本划线接种于合适的培养基（例如，哥伦比亚血琼脂），鉴定并分离潜在病原体。进行革兰氏染色以....

结果

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）是一种新颖、快速且经济的微生物常规诊断方法。通过MALDI-TOF MS进行细菌种属鉴定所获得的谱图主要由核糖体蛋白组成，同时也包含其他“在功能上高度保守、受环境条件影响极小的管家蛋白”¹⁷。该微生物鉴定系统（mMIS）的数据库包含大量参考谱图，甚至能够可靠地鉴定临床上罕见的细菌分离株^7,56,57。评分值用于反映鉴定结果的可靠性：评分高于2.300表示极有可能的种属鉴定；评分在2.000至2.300之间表示可靠的种属鉴定；评分在1.700至2.000之间表示可能的种属鉴定；而低于1.700的评分则不可靠。当出现多个种属的评分均高于2.000时，需结合其他附加检测方法，这也是我们联合使用多种技术的原因，例如16S rDNA测序、API系统以及针对细菌形态和/或表型特征的技术，如革兰染色、运动性检测等etc.。当评分低于1.700时，也必须采用上述方法以获得可靠的种属鉴定结果。近期已有研究展示了MALDI-TOF MS与16S rDNA测序相结合的应用<.......

讨论

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和16S rRNA基因测序均可用于鉴定大量不同种类的细菌。MALDI-TOF MS是一种快速、经济且操作简便的方法，且已有大量细菌质谱数据库可供使用。因此，MALDI-TOF MS是一种快速、经济高效且可靠的筛查方法，适用于以罕见细菌病原体为重点的研究^17,20,39,51。在一项比较MALDI-TOF MS与其他表型鉴定方法的前瞻性研究中，Seng et al. 证实了MALDI-TOF MS在成本效益和速度方面的优势⁵⁹，Tan et al. 报道其在实验室环境中每年可将细菌鉴定所需的试剂和人力成本降低56.9%⁶²。Gaillot et al. 的研究也支持了此类成本的降低²⁸

另一方面，16S rDNA测序耗时更长、操作繁琐，且需要专业人员进行分析³⁴。然而，这两种方法均适用于常规诊断，并已证明联合使用可提高结果的可靠性与鉴定准确性，尤其在结果存疑时更具.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CHROMASOLV，HPLC 级水，1 L	Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany	270733
Tissue Lyser LT	Qiagen, Hilden, Germany	85600	振荡式匀浆器
玻璃珠 1.0 mm	VWR International, Darmstadt, Germany	412-2917
Thermomixer 5436	Eppendorf, Hamburg, Germany	2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250)	Qiagen, Hilden, Germany	51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U)	Qiagen, Hilden, Germany	201225
正向引物 TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)	biomers.net, Ulm, Germany	-
反向引物 RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´)	biomers.net, Ulm, Germany	-
Mastercycler	Eppendorf, Hamburg, Germany	-	热循环仪
反应管 1.5 ml	SARSTEDT, Nümbrecht, Germany	72,692
反应管 2 ml	SARSTEDT, Nümbrecht, Germany	72,693,005
PCR 8孔管条盖	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany	711040X
PCR 8孔软管条	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany	711030X
Sharp R-ZV11	Sharp Electronics, Hamburg, Germany	-	微波炉
Titriplex III (EDTA Na2-盐脱水物；1 kg)	Merck, Darmstadt, Germany	1084211000
SeaKem LE 琼脂糖	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany	849006
SmartLadder SF - 100 至 1,000 bp	Eurogentec, Lüttich, Belgium	MW-1800-04
溴酚蓝 (25 g)	Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany	B0126
二甲苯青 FF (10 g)	Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany	X4126
ComPhor L Maxi	Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany	-
溴化乙锭溶液 1% (10 ml)	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	2218.1
Gel Doc 2000	Bio-Rad Laboratories, München, Germany	-	凝胶成像系统
ExoSAP-IT (500 次反应)	Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom	78201
缓冲液 (10x) 含 EDTA	Life Technologies, Darmstadt, Germany	402824
BigDye Terminator Kit v1.1	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4337450
Hi-Di 甲酰胺 (25 ml)	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250)	Qiagen, Hilden, Germany	63206
3130 遗传分析仪	Life Technologies, Darmstadt, Germany	-	测序仪
带条形码的 MicroAmp 光学 96 孔反应板	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4306737
3130 遗传分析仪，96 孔板底座	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4317237
3130 遗传分析仪，96 孔板固定夹	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4317241
3130 遗传分析仪，孔板密封垫	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4315933
3130 遗传分析仪，POP-7 聚合物，7 ml	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4352759
3130 遗传分析仪，4 毛细管阵列，50 cm	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4333466
测序分析软件 5.4	Life Technologies, Darmstadt, Germany	-
microflex	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	-	我们的 mMIS
VITEK MS	bioMérieux, Nürtingen, Germany		第2代 mMIS
flexControl 3.4	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	-	设备控制软件
Biotyper 实时分类 3.1 (RTC)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	-	分析软件
α-氰基-4-羟基肉桂酸 (HCCA)，1 g	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	201344
肽校准标准品 II	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	222570
MSP 96 靶板，抛光钢	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8224989
peqGREEN	peqlab	37-5010
MALDI Biotyper Galaxy	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	Part No. 1836007	自动化样品制备系统
Vitek 2	bioMérieux, Nürtingen, Germany		我们的 aMIS
MicroScan	Beckman Coulter, Krefeld, Germany		第2代 aMIS
BD Phoenix™ 自动化微生物系统	BD, Heidelberg, Germany		第3代 aMIS
Staphylococcus aureus 亚种 aureus Rosenbach (ATCC® 25923™)	American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France		PCR 阳性对照